急性腦缺血大鼠鼻腔給予rhEPO治療后腦組織中Ngb 和TNF－α的表達1）

柴秀琴，郭軍紅

腦血管病的治療一直是人們關注的焦點。近年來研究表明EPO對缺血性腦損傷具有神經保護作用[1，2]，且外源性EPO可通過血腦屏障進入顱內[3]。在動物實驗中，傳統采用EPO腹腔給藥的方法，其發揮作用的適宜劑量偏高，且產生多種副反應。鼻腔給藥是一種新型的給藥方法，它具有腦靶向性[4]。通過鼻腔靶向藥物直接進入中樞神經系統的給藥方法，可以使藥物的全身毒性反應降低，組織特異性的藥物濃度明顯升高[5]。本實驗對腦缺血大鼠小劑量rhEPO鼻腔給藥，通過測量腦組織含水量，腦梗死體積，腦組織中腫瘤壞死因子α（TNF－α）和神經球蛋白（Ngb）的表達，證實rh EPO鼻腔給藥方式的可行性，進一步探討rhEPO對缺血性腦損傷的保護機制。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 54只健康雄性SD大鼠，體重250 g～300 g，由山西醫科大學動物實驗中心提供。將其隨機分為對照組、模型組、rhEPO治療組，每組18只。每組隨機選取6只行腦組織含水量測定，6只行腦梗死體積測定，6只進行免疫組織化學法檢測TNF－α與Ngb的表達。

1.2 實驗方法

1.2.1 模型制作 采用Zea－Longa改良線栓法[6]制備大鼠永久性局灶性腦缺血（p MCAO）模型。通過Longa[6]的5級4分制評分法作為模型成功的判定標準。rh EPO治療組在缺血1 h鼻腔給予小劑量rhEPO（48 U/40μL），模型組和對照組在缺血1 h鼻腔給予等量的生理鹽水。缺血24 h后斷頭處死大鼠，取出完整腦組織。

1.2.2 鼻腔給藥 按照van den Berg等[7]鼻腔給藥的方法。rh EPO治療組大鼠在腦缺血1 h后，將其固定于立體定位架，保持－70°角仰臥，用微量注射器取rhEPO（48 U/40μL），分別將藥液緩慢滴入兩側鼻孔，不超過20 min，給藥后保持體位30 min，以避免藥物丟失。對照組和模型組給予40μL生理鹽水，給藥方法同rhEPO治療組。

1.3 指標的測定及方法

1.3.1 腦含水量的測定 采用干、濕重法。大鼠在缺血24 h用10%水合氯醛深麻醉后斷頭處死，取出完整腦組織，切除嗅球、小腦以及腦干，將腦組織沿大腦中線切開，取左側大腦半球，快速在分析天平上稱取濕重，然后將其置于100℃烤箱內烘24 h后至恒重，再稱取其干重，用（濕重－干重）/濕重的百分比來表示腦組織含水量。

1.3.2 腦梗死體積的測定 采用TTC染色法。大鼠在缺血24 h用10%水合氯醛深麻醉后斷頭處死，取出完整腦組織，迅速將其置于－20℃冰箱，冷凍20 min后取出，由額極向后均勻切成2 mm厚的冠狀位切片，浸于2%的TTC磷酸鹽緩沖液中，置于37℃的水浴箱中染色30 min，然后在4%的多聚甲醛溶液中固定12 h，取出后用數碼相機照相，最后利用圖像分析軟件計算出每片腦組織梗死區域的面積，其面積之和乘以腦片厚度即為腦梗死體積。為了消除腦水腫的影響，梗死區域體積用占對側大腦半球體積的百分比來表示。

1.3.3 免疫組織化學法檢測 用10%水合氯醛深度麻醉大鼠，剪開胸腔暴露心臟，用37℃生理鹽水200 mL經心臟灌注，再用4%多聚甲醛300mL灌注固定后斷頭取腦，取視交叉后1 mm～4 mm中段腦組織，常規梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋并切片，嚴格按免疫組化步驟檢測TNF－α與Ngb的表達。每只大鼠取相同部位的切片各3張，每張切片在高倍鏡（10×40）下隨機選取缺血皮層區域內5個非重疊視野，利用BI－2000醫學圖像分析系統測量陽性細胞數并取平均值，再計算各組均數與標準差。

1.4 統計學處理 采用SPSS13.0統計軟件包進行統計分析，實驗數據用均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，方差不齊者采用非參數Kruskal Wallis檢驗。

2 結 果

2.1 各組大鼠腦含水量測定（見表1）

表1 各組大鼠腦組織含水量比較（±s） %

表1 各組大鼠腦組織含水量比較（±s） %

與對照組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05

腦含水量對照組組別 n 6 78.54±0.62模型組 6 85.13±0.371）治療組 6 81.25±1.831）2）

2.2 各組大鼠腦梗死體積測定（見表2） TTC染色結果顯示，腦組織梗死灶呈白色，正常組織呈紅色。對照組無梗死體積。模型組左側半球梗死灶主要位于額頂葉皮質。與模型組相比，rh EPO治療組腦梗死體積明顯減小，差異有統計學意義（P＜0.05）。

表2 各組大鼠腦梗死體積比較（±s） %

表2 各組大鼠腦梗死體積比較（±s） %

與對照組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05

腦梗死體積對照組組別 n 6 0模型組 6 41.57±1.811）治療組 6 26.81±1.921）2）

2.3 免疫組化方法檢測Ngb、TNF－α的表達（見表3） 對照組腦組織可見少量的表達，而模型組腦組織可見較多的陽性細胞。與模型組相比，rhEPO治療組TNF－α的陽性細胞數則明顯減少，兩者差異有統計學意義。Ngb，對照組可見少量陽性細胞表達。模型組鏡下可見陽性表達，主要位于血管內皮細胞和活化的星形膠質細胞。與模型組相比，rhEPO治療組可見較多的血管內皮細胞和星形膠質細胞呈陽性表達，陽性細胞數增多，差異有統計學意義。

表3 各組大鼠TNF－α的陽性細胞數比較（±s）

表3 各組大鼠TNF－α的陽性細胞數比較（±s）

與對照組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05

組別 n TNF－α Ngb 6 7.12±1.38 8.36±1.62模型組 6 29.95±1.941） 21.80±1.091）治療組 6 16.71±1.691）2） 29.73±2.571）2）對照組

3 討 論

大量的實驗證明EPO對腦缺血有神經保護作用，其發揮作用可能與抗炎癥[8]、抗神經細胞凋亡[9]、抗氧化[10]、促進血管生成[11]和調節 NO 的合成[12]有關。

鼻腔給藥是一種新型的給藥方法，藥物經鼻腔進入顱內主要有三條通路：嗅神經通路、嗅黏膜上皮通路和血液循環通路。前兩種途徑藥物經鼻腔直接入顱，嗅神經通路是藥物在嗅區黏膜通過胞吞或胞飲被嗅神經元軸突攝取，經過軸突、神經束，再越過篩板到達嗅球，最后經嗅束進入顱內。嗅黏膜上皮通路是藥物通過胞飲、簡單擴散或載體轉運等方式進入嗅神經周圍的支持細胞或細胞間隙進入顱內。血液循環通路途徑是藥物經呼吸區豐富的毛細血管網吸收進入血液循環后再通過血腦屏障入顱。大多數小分子物質是通過嗅黏膜上皮通路吸收入腦；rh EPO是一種大分子糖蛋白，分子量高，rhEPO鼻腔給藥可能是通過嗅神經通路到達腦組織。

TNF－α是炎癥反應的始發因子，研究表明其在腦缺血早期的過度表達會加重腦損害的炎癥反應，而在損傷修復階段的低表達則可以促進損傷組織的修復[13]。本實驗對照組腦組織中可見TNF－α的少量表達，模型組缺血皮質區可見大量的TNF－α表達，腦組織的損傷程度與TNF－α的表達程度平行相關，腦缺血1 h鼻腔內給予rh EPO，24 h后病灶區TNF－α的表達下降，腦組織損害減輕，提示鼻腔給予rh EPO可能通過抑制病灶區TNF－α的表達發揮其抗炎作用。

神經球蛋白是由Burmester等[14]德國科學家于2000年首先發現的一種攜氧球蛋白，主要分布于神經系統。體外實驗[15]證實，在缺血或缺氧條件下，Ngb的表達上調，且主要在缺血半暗帶神經元中表達，缺血壞死中心的表達相對較低，其在腦組織中發揮作用可能與其清除NO有關[16]。EPO可以促進神經細胞中Ngb的表達[17]。在本實驗中對照組腦組織可見Ngb的表達，模型組缺血皮質區可見Ngb的表達增加，腦缺血1 h鼻腔內給予rhEPO，可看到rhEPO治療組Ngb的表達明顯增加，提示鼻腔給予rhEPO可能通過促進Ngb的表達來發揮神經保護作用。

本實驗通過對腦缺血大鼠鼻腔給予rhEPO，結果顯示Ngb的表達增加，TNF－α的表達降低，表明rh EPO鼻腔給藥是一種有效的給藥途徑，rhEPO對腦缺血大鼠具有神經保護作用。然而rh EPO鼻腔給藥后是否會引起鼻黏膜的損傷，是否會導致誤吸，是否會因為嗆咳而影響給藥劑量等等，還需進行更進一步的研究。

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