骨髓間充質干細胞與血管內皮生長因子聯合移植對大鼠創傷性腦損傷修復的研究1）

梁 磊，陳來照，段虎斌，郝 強，成 睿

創傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）的發病率已居全身各種創傷的首位，極大地影響患者的生命健康和生活質量，給患者家庭和社會造成了極大的負擔[1]。由于神經元的再生能力極差，目前尚無理想的治療方法。目前大量研究顯示，移植骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）治療各種腦損傷是一種潛力巨大的療法[2]。然而，TBI發生時，腦血管在暴力作用下直接遭到破壞，繼而出現的腦水腫又進一步加重腦缺血的程度。這樣，在腦缺血環境下，單純移植BMSCs能否獲得滿意療效令人擔憂。血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在體內是促血管生成劑。聯合移植BMSCs與外源性VEGF能否通過改善受損腦組織的微循環而提升療效？這一療法對腦組織中腦源性神經營養因子（brainderived neurotrophic factor，BDNF）等細胞因子的表達有何影響？本研究將就此做一初步探討。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔雄性2月齡SD大鼠2只，體重210 g，用于培養BMSCs；清潔雄性3月齡SD大鼠40只，體重220 g～250 g，用于建立TBI模型。均由山西醫科大學實驗動物中心提供。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 試劑 DMEM培養基（Hyclon，北京）；無支原體胎牛血清（杭州四季青）；胰酶蛋白（Solarbio，北京）；一抗BDNF兔多克隆抗體（Epitomics，美國加利福尼亞）；即用型SABC免疫組化染色試劑盒（博士德，武漢）。

1.2.2 儀器 超低溫冰箱（SANYO，日本）；高溫蒸汽滅菌器（新諾，上海）；臺式低溫高速離心機（Minispin plus Eppendorf，德國）；超凈工作臺（博迅，上海）；CO2恒溫培養箱（Thermo，美國）；倒置相差顯微鏡（Leica，德國）；臺式牙科鉆；自由落體垂直打擊儀（太原鋼鐵集團加工）；微量注射器；大鼠腦立體定向儀（軍事醫學科學院加工）。

1.3 TBI模型的建造 將40只SD大鼠隨機分為單獨移植BMSCs組（BMSCs組）、單獨應用VEGF組（VEGF組）、聯合移植BMSCs與VEGF組（V＋B組）及對照組，每組10只。采用改良的Feeny自由落體撞擊方法建造中度TBI模型[3]。用5%水合氯醛腹腔注射將大鼠麻醉并俯臥固定于立體定向儀，頭皮消毒，做頂部正中切口，用牙科鉆在矢狀縫右2 mm和冠狀縫前2 mm交點處開直徑4 mm骨窗。將骨窗與自由落體垂體打擊儀連接妥當，以300 g/cm（50 g重錘，下落距離6 cm）功力沖擊大腦皮層。

1.4 BMSCs的分離與培養 SD大鼠2只，處死取雙側股骨，75%酒精浸泡5 min，在超凈工作臺上剪斷兩端，將骨髓沖出制成細胞懸液。1 000 r/min離心10 min，棄上清，用DMEM再懸沉淀，1 000 r/min離心10 min，棄上清，得骨髓細胞。用含12%胎牛血清的培養基制成細胞懸液，以1.0×105個/mL接種于加有DMEM培養基的培養瓶中，37℃5%CO2飽和濕度孵箱培養。24 h后第1次全量換液。3 d后見細胞覆蓋視野50%，用0.25%胰蛋白酶消化1 min，制成單細胞懸液1mL，分裝入兩個培養瓶進行培養。72 h后全量換液。接種7 d后見第一代細胞長滿瓶底。

1.5 立體定向移植 造模后第7天，將大鼠頭部固定于立體定向儀上，用1 0μL微量注射器分別將濃度為2×1 06/L的BMSCs細胞懸液、濃度為10 ng/mL的VEGF、含有2×106個BMSCs和0.01 ng VEGF的細胞懸液及PBS液各1μL緩慢注入相應組傷灶周邊，進針深度2 mm。注射后14 d，處死取腦，制成片厚4μm的冠狀石蠟切片。

1.6 HE、尼氏及免疫組化染色 常規HE染色。用甲苯胺藍溶液行尼氏染色。用p H＝6.0枸櫞酸鹽溶液行高壓熱抗原修復1 min 30 s，加5%BSA后，滴加一抗（1∶100），4℃過夜。依次滴加二抗及SABC。DAB顯色，復染。

1.7 數碼照片的拍攝 應用Image Analysis System 10.0軟件進行拍攝。在10×40倍視野下，每張切片拍攝半暗帶及健側對稱部（以下簡稱對稱部）共2個部位，每個部位隨機拍攝10個不連續的視野。

1.8 BDNF數據的采集 以細胞漿及部分胞核中表現有棕黃色顆粒的細胞為BDNF陽性細胞。應用IPP 6.0軟件進行數據采集。選取陽性細胞中的棕黃色區域，軟件自動計算每個區域的累積光密度（IOD，Integrated Optical Density）值，以總和IOD代表每個視野下的BDNF含量。以10個視野總和IOD的平均值代表該部位BDNF含量。

1.9 統計學處理 采用SPSS 11.3軟件分析?？偤虸OD均值以均數±標準差（±s）表示，實驗組與對照組總和IOD均值間的比較采用單因素方差分析后最小顯著差（LSD）t檢驗，各組對稱部與半暗帶總和IOD均值間的比較采用配對t檢驗。

2 結 果

2.1 HE染色 對稱部間質致密，神經元形態正常?？梢娚倭啃∧z質細胞及星形膠質細胞；半暗帶間質略疏松，神經元水腫、密度較對稱部略低，偶可見皺縮神經元。BMSCs組及V＋B組，顆粒細胞層內均可見呈梭形的BMSCs，梭尾朝向分子層。在移植組的半暗帶內可見BMSCs。

2.2 尼氏染色 神經元胞漿內均可見嗜堿性團塊狀或顆粒狀尼氏體，半暗帶內尼氏體數量較對稱部略少。

2.3 免疫組化染色（見表1） BDNF陽性細胞分布廣泛，在大腦皮層各層、海馬、丘腦等部位均可見到。與陰性對照切片相比，陽性切片中BDNF主要表達于神經元、小膠質細胞、星形膠質細胞和移植的骨髓間充質干細胞。陽性顆粒主要位于胞漿內，呈環狀，在部分胞核內亦可見少量陽性顆粒。

表1 兩組半暗帶總和IOD均值間的比較（±s）

表1 兩組半暗帶總和IOD均值間的比較（±s）

與對照組比較，1）P＜0.05

均值之差BMSC組 15 171±3 045組別 半暗帶總和IOD均值 半暗帶與對稱部總和IOD 526±3 092 VEGF組 18 377±2 220 －3 728±5 0891）V＋B組 21 184±4 8631） －3 332±2 9361）對照組 17 195±4 338 －5 973±4 6961）

3 討 論

BMSCs是指來源于骨髓，具有多系多向分化潛能，并具有貼壁生長性的成纖維細胞樣間充質干細胞[4]。在生長特征方面具有貼壁生長性，在形態方面具有梭形的特征[5]。本實驗培養與移植的BMSCs均具有上述特點。

BDNF是神經營養因子家族成員之一，廣泛分布于腦組織[6]。具有下列生物學作用：抑制興奮性氨基酸的毒性；對抗細胞內高鈣；抗氧自由基；抑制細胞凋亡；促進神經干細胞的增殖、遷移與分化[7]。缺血性腦損傷發生后，BDNF的表達在7 d開始升高，14 d明顯增多，21 d達高峰[8]。

半暗帶是指圍繞在中心壞死區以外的可逆性損傷腦組織[9]，是腦挫裂傷后繼發性損害的重要組成部分。減輕半暗帶病理損害與修復可逆性受損腦組織是治療創傷性腦損傷的重要目標。

根據統計學結果，可以認為聯合移植組半暗帶中BDNF含量較對照組高。目前，BMSCs移植治療TBI的機制主要有如下學說：BMSCs直接分化為神經樣細胞，替代受損細胞發揮作用；BMSCs通過自分泌或旁分泌作用促進受損腦組織修復；BMSCs調節受損腦區炎癥因子的表達，抑制炎癥反應。Runjiang等[10]證實BMSCs在體外培養時可分泌BDNF等6種生長因子。它們不僅可以抑制細胞凋亡，還能上調內源性VEGF和VEGF受體－2的表達。VEGF對血管內皮細胞具有選擇性刺激作用，可促進血管的生成。本課題組前期系列實驗證實，實驗組血管計數多于對照組；聯合移植組抑制細胞凋亡的作用明顯。故筆者認為，聯合移植組可能通過如下機制提高半暗帶中BDNF的含量：BMSCs分泌BDNF；BMSCs分泌的生長因子與外源性VEGF共同使半暗帶新生血管數量增多，微循環得以改善，進而促使BMSCs增殖、分化，促進受傷腦組織修復，最終使BDNF表達增多；BMSCs抑制半暗帶細胞凋亡及炎癥反應，進而抑制BDNF表達的減少。

根據統計學結果，可以認為除BMSCs組外，其余各組半暗帶BDNF含量均較對稱部低。尼氏染色亦支持本結論：作為蛋白質合成與分泌場所的尼氏體在半暗帶中的數量較健側對稱部少。

可以認為，TBI發生后半暗帶中BDNF含量減少，通過立體定向聯合移植BMSCs與VEGF可有效抑制該病理過程。從BDNF生物學作用分析，本方法具有減輕TBI繼發性病理損害的作用，療效可能較單純移植BMSCs更好。Miki等[11]在治療腦卒中的研究中也表明，VEGF轉基因BMSCs移植與普通BMSCs移植相比療效更好。本研究中針對BMSCs組的部分統計學結果，尚難做出合理解釋，需進一步深入研究。

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