丹紅注射液對大鼠腦外傷后AQP4表達及神經元凋亡的影響

王從政，蔡淑芳

水通道蛋白 （aquaporin，AQP）是近年來發現的一組與水通透有關的細胞膜轉運蛋白，其中AQP4（Aquaporin4，AQP4）的作用最引人注意，抑制AQP4的表達可減緩腦水腫的形成，從而降低神經系統疾病的病死率和致殘率[1]。以往認為壞死是顱腦損傷神經細胞唯一的死亡方式，近年研究表明腦外傷后神經元死亡包括壞死與凋亡兩種方式，神經元凋亡在創傷性腦損傷后水腫神經元的轉歸中占據重要地位[2]。細胞壞死不可修復，人們試圖通過對凋亡途徑的調控從而更好地改善腦外傷后的預后，這方面的研究是當前顱腦外傷研究的熱點之一。

近年來，關于丹紅注射液的腦保護作用的研究越來越多，但關于丹紅注射液對腦外傷后腦組織中AQP4的表達及神經元凋亡影響的研究較少。為此，本實驗應用大鼠建立腦外傷模型，觀察丹紅注射液對大鼠腦損傷后AQP4表達及神經元凋亡的影響，以期為腦損傷的治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 健康雄性Wistar大鼠150只（3月齡），清潔級，體重250 g～300 g，青島市動物中心提供，動物合格證號：SCXK（魯）20030010。隨機分為對照組和治療組，每組75只，每組又分為傷后6 h、12 h、24 h、48 h、72 h 5個亞組，每個亞組15只。

1.2 腦損傷模型的建立 大鼠急性腦損傷模型參照Feeney法[3]制作并加以改進。打擊器由固定支架、外周套管、打擊墊片和下擊落錘組成，擊錘重20 g，下落高度為50 cm，落體致傷力20×50（g·cm）。大鼠10%水合氯醛腹腔注射麻醉后（0.4mL/100 g體重），俯臥位固定在手術臺上，常規消毒皮膚，備皮，沿矢狀縫切開頭皮，暴露右頂骨，在人字縫前2 mm，矢狀縫右側2 mm處用牙鉆行顱骨鉆孔并擴大成5 mm×5 mm骨窗，保持硬腦膜完整，將直徑5 mm圓墊片放于骨窗處，將大鼠俯臥固定于一已知彈性系數的海綿床上，移至有機玻璃管下端 ，墊片正對有機玻璃管中央，有機玻璃管上方置一滑輪，在銅柱上端系一小繩，將滑輪調整至繩索跨過滑輪后銅柱處于有機玻璃管中央為止。待動物開始蘇醒，有肢體活動時，將銅柱由預定高度自由墜落于不銹鋼墊片上，立即移開海綿床以免再次損傷，下陷深度約2 mm。下落擊錘致右頂葉腦損傷后縫合頭皮。

給藥過程：治療組大鼠致傷后1 h腹腔內注射1.5mL/kg丹紅注射液；對照組致傷后1 h腹腔內注射同體積生理鹽水。

1.3 腦組織取材及處理 在預定各時間點，每組取5只大鼠，斷頭取腦后用濾紙蘸凈大腦表面水分，取腦損傷周圍腦組織150 g左右，用電子分析天平稱大腦半球濕重，然后放入110℃烤箱烘烤24 h，再稱干重。每組剩余10只大鼠在預定各時間點經腹腔注射10%水合氯醛麻醉（0.5mL/100 g體重），常規胸腹聯合切口，經心尖將灌注針插入主動脈，依次用生理鹽水500 mL、4℃的4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液500mL灌注固定。斷頭后沿冠狀面提取腦損傷部位前后2 mm組織，后固定2 h，洗滌4 h，常規梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋。連續冠狀切片，片厚5μm，貼片后室溫保存備用。

1.4 觀察指標

1.4.1 大腦半球含水量測定 用干濕重法計算腦含水量，即腦含水量＝（濕重－干重）/濕重×100%。

1.4.2 HE染色 石蠟切片常規脫臘至水，蘇木精伊紅染色，光鏡觀察損傷及周邊區神經元形態。

1.4.3 AQP4表達免疫組化檢測 兔抗鼠AQP4多克隆抗體及SABC免疫組化試劑盒均購自武漢博士德公司，按試劑盒說明書操作，DAB顯色，光鏡觀察。每只動物取三張連續切片，每張切片高倍鏡下（400倍）隨機觀察損傷周邊區不重疊的2個視野，計數AQP4陽性細胞平均數，以個/高倍鏡視野表示。

1.4.4 TUNEL法檢測細胞凋亡 原位未端標記（TUNEL）試劑盒由武漢博士德生物工程公司提供，按說明書操作，DAB顯色，光鏡觀察。細胞核中出現棕黃色顆粒者為TUNEL陽性細胞，即凋亡細胞。每只動物取三張連續切片，每張切片高倍鏡下（400倍）隨機選取損傷周邊區不重疊的2個視野，計數TUNEL陽性細胞平均數，以個/高倍鏡視野表示。

2 結 果

2.1 丹紅注射液對大鼠腦損傷后腦含水量的影響 與對照組比較，治療組各時間點腦組織含水量減少，其中在傷后12 h及24 h時與對照組比較差異有統計學意義（P＜0.01）。詳見表1。

表1 丹紅注射液對大鼠腦損傷后腦含水量的影響（±s） %

表1 丹紅注射液對大鼠腦損傷后腦含水量的影響（±s） %

與對照組比較，1）P＜0.05，2）P＜0.01

72 h對照組 80.02±2.35 82.31±1.48 83.86±2.37 83.34±1.3組別 傷后6 h 傷后12 h 傷后24 h 傷后48 h 傷后1 79.41±1.47治療組 76.09±1.191） 77.34±2.352） 78.01±2.212） 80.78±1.431） 77.21±1.391）

2.2 HE染色 對照組創傷區細胞間隙和血管周圍間隙增寬，有神經元和膠質細胞壞死、崩解；損傷周圍區神經元胞體明顯腫脹，血管內皮細胞腫脹，細胞水腫，少量膠質細胞增生，有大量炎性細胞滲出，局部可見到炎性細胞聚集和紅細胞滲出。在高倍鏡下觀察，損傷周圍區較多神經元外形皺縮，核染色質濃縮、深染，核膜境界不清，細胞間隙增大，呈現典型凋亡細胞核形態。提示在創傷中心區細胞多表現出壞死，在損傷周圍區，細胞多表現為凋亡。丹紅注射液治療組在創傷區及損傷周圍區上述病理學改變明顯減輕，壞死及凋亡細胞較對照組明顯減少。

2.3 AQP4表達免疫組化檢測 AQP4陽性反應產物呈棕黃色顆粒，主要分布在胞膜，胞質和胞核中少見，陽性細胞呈空泡狀，主要位于創傷周邊的水腫區、創傷側的皮質和血管周圍及白質的星形膠質細胞、脈絡叢、室管膜等處。兩組AQP4陽性神經元計數見表2。對照組腦外傷后6 h，AQP4的表達即開始增高，傷后24 h～48 h達到高峰，至72 h時已明顯下降。與對照組比較，治療組在相應時間點AQP4陽性細胞數均降低，其中在傷后12 h及24 h時與對照組比較有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。

表2 兩組腦損傷后周圍水腫區AQP4表達比較（±s） 個/高倍鏡視野

表2 兩組腦損傷后周圍水腫區AQP4表達比較（±s） 個/高倍鏡視野

與對照組比較，1）P＜0.05，2）P＜0.01

72 h對照組 27.00±5.88 43.42±5.65 58.88±6.23 41.71±3.4組別 傷后6 h 傷后12 h 傷后24 h 傷后48 h 傷后1 18.83±2.39治療組 21.46±3.411） 34.17±4.742） 40.83±3.172） 36.42±5.541） 15.00±3.801）

2.4 TUNEL法檢測細胞凋亡 光鏡觀察，細胞核中出現棕黃色顆粒者為TUNEL陽性細胞，即凋亡細胞，主要位于打擊灶周邊區。兩組凋亡神經元計數見表3，對照組在傷后6 h即可檢測到少量凋亡神經元，傷后24 h～48 h達到高峰，而此后凋亡細胞數則呈現下降趨勢。丹紅注射液治療組在上述各時相點則檢測到較對照組明顯減少的凋亡細胞，在傷后24 h及48 h與對照組比較差別有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。

表3 兩組腦損傷后周圍水腫區神經元凋亡比較（±s） 個/高倍鏡視野

與對照組比較，1）P＜0.05，2）P＜0.01

72 h對照組 15.25±5.85 32.75±4.39 39.83±5.61 34.17±3.6組別 傷后6 h 傷后12 h 傷后24 h 傷后48 h 傷后1 21.25±4.17治療組 10.00±3.621） 26.25±3.042） 29.33±4.022） 24.67±5.061） 16.20±4.041）

3 討 論

水通道蛋白是近年來新發現的一個膜通道蛋白家族，在介導水跨胞膜的流動中起關鍵作用，在腦內分布廣泛，其中AQP4目前被認為是介導腦組織中水分子流動的最主要的水通道蛋白，成為腦水腫研究的焦點。它的表達變化對外傷性腦水腫非常敏感，抑制AQP4可為減輕腦水腫提供新的治療途徑[1]。

本實驗結果表明，對照組造模后腦組織含水量為一動態變化的過程，在腦外傷后進行性發展，24 h～48 h達到高峰，然后逐步回落至接近正常。這和臨床上腦外傷患者病情多在2 d內惡化相一致。AQP4蛋白的表達也呈現出這一趨勢，與腦含水量有明顯的相關性，這與以前研究的結論相同[4]。

近幾年，經過一系列的腦外傷動物模型及人腦組織標本的研究證實了腦外傷后細胞凋亡參與了繼發性腦損傷的發展過程。研究表明，在機械性腦損傷后早期在外力打擊較嚴重的中心區主要表現為細胞壞死，而在外力打擊相對較輕的損傷灶周邊部位，傷后一段時間內表現為細胞凋亡[5，6]。細胞壞死不可修復，人們試圖通過對凋亡途徑的調控而更好地改善預后，在外傷性腦損傷中，通常所說的腦保護效應，主要是避免神經元的遲發性損傷，以圖打斷病變發展進程，使腦功能受損減到最低程度。本實驗中，對照組HE染色及TUNEL染色都表明在損傷灶附近細胞凋亡是伴隨著細胞壞死的病理過程，這兩種不同的死亡過程共同參與了神經元的丟失。

丹紅注射液是丹參和紅花提取物的中藥制劑，臨床及實驗研究表明，丹參可提高抗凝和纖溶功能，對動脈粥樣硬化的形成也有抑制作用，可改善微循環，清除氧自由基，抗脂質過氧化損傷，拮抗鈣離子內流，改善ATP酶活性。紅花可以抗凝血，抑制血栓形成，所含的紅花黃色素具有抗氧化作用，可通過抑制腎素－血管緊張素系統具有降血壓作用[7]，紅花提取物有Ca2＋拮抗作用，可防止腦缺血致神經內Ca2＋濃度超負荷而造成的腦損傷。

腦損傷后，病人常出現紅細胞聚集，血流緩慢以及血漿纖維蛋白原升高等現象[8]。血黏度升高及紅細胞聚集性增強可使腦血流淤滯，循環阻力增高，最終導致腦微循環障礙，腦缺血缺氧，加劇腦水腫和繼發性腦損壞。丹紅注射液可以通過改善腦循環血液流變學性質，增加腦組織血流，糾正缺血缺氧所致的神經元代謝紊亂，從而減輕腦水腫和繼發性腦損害。同時丹紅注射液具有Ca2＋拮抗作用，抑制神經元膜脂質過氧化，維持神經元細胞內離子內環境平衡，而發揮腦保護作用。最新研究表明[9]丹參能降低腦內單胺類、肽類等介質代謝紊亂，減輕腦水腫。

神經細胞凋亡受基因調控，如bcl－2的表達降低或bax表達增多與神經細胞凋亡高度相關。最近研究證實丹參注射液可抑制bcl－2表達降低與bax表達增多。當腦缺血發生后，丹參能下調另一細胞凋亡相關基因白細胞介素－1β轉化酶（ICE）的表達，上調腦缺血后的bcl－2表達而發揮其神經保護作用[9]。

臨床上丹紅注射液常用于冠心病、心絞痛、心肌梗死、瘀血型肺心病、缺血性腦病、腦梗死，腦水腫等心腦血管疾病的治療，對急性腦梗死患者療效顯著[10]。本實驗中丹紅注射液治療組AQP4表達較對照組表達明顯減少，自傷后6 h～72 h都有不同程度的減少。TUNEL染色也顯示丹紅注射液治療組神經元凋亡較對照組表達明顯減少。兩組染色都顯示在傷后12 h及24 h時與對照組比較差異有統計學意義，說明丹紅注射液對顱腦損傷后腦水腫及神經元凋亡有明顯的治療作用，且這一治療作用在傷后12 h至24 h時最為顯著。本試驗結果提示對于腦外傷病人有針對性地使用丹紅注射液對病人的預后可能會有所幫助，但其發揮腦保護作用的用藥劑量與時機還需要更進一步的研究。

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