炮制骨碎補的提取及其柚皮苷的純化研究

馬才敬 ，方 謹 ，李玲玲 ，王 允

(1.四川泰華現代中藥所，四川 成都 618300; 2.重慶郵電大學，重慶 400065)

骨碎補為水龍骨科植物槲蕨 Drynaria fortunei(Kunze)J.Sm.的干燥根莖，全年均可采挖，除去泥沙，干燥，或者再燎去茸毛(鱗片)。骨碎補性味苦溫，歸腎、肝經，具有補腎強骨、續傷鎮痛功效，用于腎虛腰痛、筋骨折傷、耳鳴耳聾、跌打閃挫、牙齒松動，外治斑禿、白癜風等癥。槲蕨根莖含淀粉16.4%，葡萄糖5.37%，還含主要活性成分柚皮苷[1]。筆者建立了測定藥材中柚皮苷含量的高效液相色譜法，并優化了炮制骨碎補的提取純化方法，報道如下。

1 儀器與試藥

Agilent 1200型高效液相色譜儀。柚皮苷對照品(由重慶中藥研究院提供，批號為110722－200309，供含量測定用);乙腈為色譜純，水為純化水，其他試劑均為分析純。砂炮骨碎補購于南坪醫藥公司，經重慶郵電大學生物信息學院中藥鑒定學劉毅老師確認為槲蕨科骨碎補。

2 方法與結果

2.1 柚皮苷含量測定

2.1.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱:Phenomenex C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動相:乙腈－水－冰乙酸(27∶72∶1);流速:1 mL/min;柱溫:30℃;測定波長:283 nm;進樣量:5 μL。在此條件下，理論板數按柚皮苷峰計算應不低于3000，保留時間為4.712 min，色譜圖見圖1。

2.1.2 溶液制備

取本品粗粉約0.2 g，精密稱定，置錐形瓶中，加甲醇30 mL，加熱回流3 h，放冷，濾過，濾液置50 mL量瓶中，用少量甲醇分數次洗滌容器，洗液濾入同一量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得供試品溶液。精密稱取柚皮苷對照品0.6 mg，置10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得每1 mL含柚皮苷0.6 mg的對照品溶液。

2.1.3 方法學考察

圖1 高效液相色譜圖

線性關系考察:分別精密吸取柚皮苷對照品溶液(0.6 g/L)2，4，6，8，10，12 μL，注入高效液相色譜儀，測定峰面積。以峰面積對數值為縱坐標、進樣量為橫坐標繪制標準曲線，得回歸方程 Y=1836X－6.84，R2=0.9998(n=5)。結果表明，柚皮苷進樣量在0.1606～0.9638μg范圍內與峰面積對數值呈良好的線性關系。

精密度試驗:取柚皮苷對照品溶液(0.6 g/L)，連續進樣6次。結果峰面積的 RSD=0.282%(n=6)，表明儀器精密度良好。

穩定性試驗 :取同一供試品溶液，分別于 0，2，4，8，12 h 時進樣，測定峰面積。結果的 RSD=0.247%(n=5)，表明供試品溶液至少在12 h內穩定。

重復性試驗:取同一批樣品(批號為060316)，依法制備6份供試品溶液，按擬訂的色譜條件測定含量。結果含量的 RSD=1.66%(n=6)，表明方法重復性好。

加樣回收試驗:取同一批已知含量的樣品，取9份各1g，精密稱定，每3份一組分別精密加入柚皮苷對照品溶液(0.6 g/L)各0.8，1，1.2 mL，按供試品溶液制備方法制備溶液并依法測定，計算回收率。結果見表1。

表1 柚皮苷加樣回收試驗結果(n=9)

2.1.4 樣品含量測定

取3批樣品，依法制備供試品溶液并測定。結果每1 g藥材含柚皮苷的量分別為580，584，582 mg。據樣品含量測定結果，暫訂本品每1 g骨碎補以柚皮苷計不得少于580 mg。

2.2 炮制骨碎補的提取

根據相關文獻，骨碎補的提取以水提與60%乙醇提取為主，故分別采用兩種方法試驗。

水提[2]:取骨碎補藥材，用粉碎機將藥材打成粉末，取粉末100 g;將粉末用濾紙包裹，再用紗布包裹好，置鍋內;將藥材包和Ⅱ級蒸餾水按1∶10(W/V)混合，浸泡30 min，常規煎煮2次;以2500 r/min離心10 min;取上清，旋轉蒸發濃縮成2 g/mL的藥液。

60%乙醇提取[3]:加10倍量的60%乙醇回收提取2次，每次1.5 h，合并提取液，減壓回收乙醇，繼續濃縮至300 mL，質量濃度相當于2 g/mL。

優選:采用高效液相色譜法測定骨碎補水提液與60%乙醇提取液中的柚皮苷含量，結果見表2。

可見，用水提取骨碎補中柚皮苷的含量與醇提法相差不大，根據生產實際，從經濟實用的角度考察，宜采用水提法。

2.3 柚皮苷的分離純化

根據骨碎補的理化性質，擬訂分離純化工藝分別為水煎醇沉和乙酸乙酯萃取。

表2 不同提取方法對柚皮苷含量的影響

水煎醇沉:取骨碎補藥材，用粉碎機粉碎成粗粉。取粉末100 g，按照上述優選條件，制成濃縮成100 mL藥液;再加95%乙醇171 mL，水煎醇沉;用旋轉蒸發儀回收乙醇。

乙酸乙酯萃取:取骨碎補藥材，用粉碎機粉碎成粗粉。取粉末100 g，按照上述優選條件，制成濃縮成100 mL藥液;加乙酸乙酯200 mL，用分液漏斗分液，去上層液體，發現上層液體有一些雜質，抽濾除去雜質;加乙酸乙酯200 mL，同樣以分液漏斗分液，用旋轉蒸發儀回收乙酸乙酯。

優選:采用高效液相色譜法測定以上兩種純化的柚皮苷含量，結果水煎醇沉液中柚皮苷含量為25.16%，乙酸乙酯萃取液中柚皮苷含量為77.05%。可見，乙酸乙酯萃取柚皮苷為較優方案。

3 討論

試驗中，曾采用不同體積分數的乙醇提取，結果50%乙醇提取的柚皮苷相對較少，70%乙醇提取的柚皮苷里含有相對較多的雜質，60%乙醇提取的柚皮苷相對含量較高、雜質較少，故選用60%乙醇作為提取溶劑。本試驗采用的流動相與2010年版《中國藥典(一部)》不同，因為乙腈－水 －冰乙酸(27∶72∶1)在 Agilent 1200型高效液相色譜儀上使用更方便。

[1]唐 琪，陳莉麗，嚴 杰.骨碎補提取物促小鼠成骨細胞株MC3T3－E1細胞增殖、分化和鈣化作用的研究[J].中國中藥雜志，2004，29(2):164－168.

[2]韋英杰，陳 寧，王 靜，等.正交實驗法優選骨碎補提取工藝的研究[J].時珍國醫國藥，2004，11(15):750－751.

[3]張 琳，楊中林.水提法與醇提法對骨碎補中總黃酮含量的影響比較[J].江蘇藥物與臨床研究，2004，3(12):30－31.