炮制骨碎補的提取及其柚皮苷的純化研究

馬才敬 ，方 謹 ，李玲玲 ，王 允

(1.四川泰華現(xiàn)代中藥所，四川 成都 618300; 2.重慶郵電大學(xué)，重慶 400065)

骨碎補為水龍骨科植物槲蕨 Drynaria fortunei(Kunze)J.Sm.的干燥根莖，全年均可采挖，除去泥沙，干燥，或者再燎去茸毛(鱗片)。骨碎補性味苦溫，歸腎、肝經(jīng)，具有補腎強骨、續(xù)傷鎮(zhèn)痛功效，用于腎虛腰痛、筋骨折傷、耳鳴耳聾、跌打閃挫、牙齒松動，外治斑禿、白癜風(fēng)等癥。槲蕨根莖含淀粉16.4%，葡萄糖5.37%，還含主要活性成分柚皮苷[1]。筆者建立了測定藥材中柚皮苷含量的高效液相色譜法，并優(yōu)化了炮制骨碎補的提取純化方法，報道如下。

1 儀器與試藥

Agilent 1200型高效液相色譜儀。柚皮苷對照品(由重慶中藥研究院提供，批號為110722－200309，供含量測定用);乙腈為色譜純，水為純化水，其他試劑均為分析純。砂炮骨碎補購于南坪醫(yī)藥公司，經(jīng)重慶郵電大學(xué)生物信息學(xué)院中藥鑒定學(xué)劉毅老師確認為槲蕨科骨碎補。

2 方法與結(jié)果

2.1 柚皮苷含量測定

2.1.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱:Phenomenex C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動相:乙腈－水－冰乙酸(27∶72∶1);流速:1 mL/min;柱溫:30℃;測定波長:283 nm;進樣量:5 μL。在此條件下，理論板數(shù)按柚皮苷峰計算應(yīng)不低于3000，保留時間為4.712 min，色譜圖見圖1。

2.1.2 溶液制備

取本品粗粉約0.2 g，精密稱定，置錐形瓶中，加甲醇30 mL，加熱回流3 h，放冷，濾過，濾液置50 mL量瓶中，用少量甲醇分數(shù)次洗滌容器，洗液濾入同一量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得供試品溶液。精密稱取柚皮苷對照品0.6 mg，置10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得每1 mL含柚皮苷0.6 mg的對照品溶液。

2.1.3 方法學(xué)考察

圖1 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察:分別精密吸取柚皮苷對照品溶液(0.6 g/L)2，4，6，8，10，12 μL，注入高效液相色譜儀，測定峰面積。以峰面積對數(shù)值為縱坐標(biāo)、進樣量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程 Y=1836X－6.84，R2=0.9998(n=5)。結(jié)果表明，柚皮苷進樣量在0.1606～0.9638μg范圍內(nèi)與峰面積對數(shù)值呈良好的線性關(guān)系。

精密度試驗:取柚皮苷對照品溶液(0.6 g/L)，連續(xù)進樣6次。結(jié)果峰面積的 RSD=0.282%(n=6)，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗 :取同一供試品溶液，分別于 0，2，4，8，12 h 時進樣，測定峰面積。結(jié)果的 RSD=0.247%(n=5)，表明供試品溶液至少在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗:取同一批樣品(批號為060316)，依法制備6份供試品溶液，按擬訂的色譜條件測定含量。結(jié)果含量的 RSD=1.66%(n=6)，表明方法重復(fù)性好。

加樣回收試驗:取同一批已知含量的樣品，取9份各1g，精密稱定，每3份一組分別精密加入柚皮苷對照品溶液(0.6 g/L)各0.8，1，1.2 mL，按供試品溶液制備方法制備溶液并依法測定，計算回收率。結(jié)果見表1。

表1 柚皮苷加樣回收試驗結(jié)果(n=9)

2.1.4 樣品含量測定

取3批樣品，依法制備供試品溶液并測定。結(jié)果每1 g藥材含柚皮苷的量分別為580，584，582 mg。據(jù)樣品含量測定結(jié)果，暫訂本品每1 g骨碎補以柚皮苷計不得少于580 mg。

2.2 炮制骨碎補的提取

根據(jù)相關(guān)文獻，骨碎補的提取以水提與60%乙醇提取為主，故分別采用兩種方法試驗。

水提[2]:取骨碎補藥材，用粉碎機將藥材打成粉末，取粉末100 g;將粉末用濾紙包裹，再用紗布包裹好，置鍋內(nèi);將藥材包和Ⅱ級蒸餾水按1∶10(W/V)混合，浸泡30 min，常規(guī)煎煮2次;以2500 r/min離心10 min;取上清，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮成2 g/mL的藥液。

60%乙醇提取[3]:加10倍量的60%乙醇回收提取2次，每次1.5 h，合并提取液，減壓回收乙醇，繼續(xù)濃縮至300 mL，質(zhì)量濃度相當(dāng)于2 g/mL。

優(yōu)選:采用高效液相色譜法測定骨碎補水提液與60%乙醇提取液中的柚皮苷含量，結(jié)果見表2。

可見，用水提取骨碎補中柚皮苷的含量與醇提法相差不大，根據(jù)生產(chǎn)實際，從經(jīng)濟實用的角度考察，宜采用水提法。

2.3 柚皮苷的分離純化

根據(jù)骨碎補的理化性質(zhì)，擬訂分離純化工藝分別為水煎醇沉和乙酸乙酯萃取。

表2 不同提取方法對柚皮苷含量的影響

水煎醇沉:取骨碎補藥材，用粉碎機粉碎成粗粉。取粉末100 g，按照上述優(yōu)選條件，制成濃縮成100 mL藥液;再加95%乙醇171 mL，水煎醇沉;用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收乙醇。

乙酸乙酯萃取:取骨碎補藥材，用粉碎機粉碎成粗粉。取粉末100 g，按照上述優(yōu)選條件，制成濃縮成100 mL藥液;加乙酸乙酯200 mL，用分液漏斗分液，去上層液體，發(fā)現(xiàn)上層液體有一些雜質(zhì)，抽濾除去雜質(zhì);加乙酸乙酯200 mL，同樣以分液漏斗分液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收乙酸乙酯。

優(yōu)選:采用高效液相色譜法測定以上兩種純化的柚皮苷含量，結(jié)果水煎醇沉液中柚皮苷含量為25.16%，乙酸乙酯萃取液中柚皮苷含量為77.05%。可見，乙酸乙酯萃取柚皮苷為較優(yōu)方案。

3 討論

試驗中，曾采用不同體積分數(shù)的乙醇提取，結(jié)果50%乙醇提取的柚皮苷相對較少，70%乙醇提取的柚皮苷里含有相對較多的雜質(zhì)，60%乙醇提取的柚皮苷相對含量較高、雜質(zhì)較少，故選用60%乙醇作為提取溶劑。本試驗采用的流動相與2010年版《中國藥典(一部)》不同，因為乙腈－水 －冰乙酸(27∶72∶1)在 Agilent 1200型高效液相色譜儀上使用更方便。

[1]唐 琪，陳莉麗，嚴 杰.骨碎補提取物促小鼠成骨細胞株MC3T3－E1細胞增殖、分化和鈣化作用的研究[J].中國中藥雜志，2004，29(2):164－168.

[2]韋英杰，陳 寧，王 靜，等.正交實驗法優(yōu)選骨碎補提取工藝的研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2004，11(15):750－751.

[3]張 琳，楊中林.水提法與醇提法對骨碎補中總黃酮含量的影響比較[J].江蘇藥物與臨床研究，2004，3(12):30－31.