白藜蘆醇對糖尿病腎損害大鼠超微結構的影響

傅松波 湯旭磊 楊曉梅 馬致遠 (蘭州大學第一醫院內分泌科，甘肅 蘭州 730000)

氧化應激與糖尿病慢性微血管并發癥密切相關〔1，2〕，抗氧化劑預防糖尿病血管并發癥的價值為人們所關注。近年來，對中醫中藥的研究發現，丹參、當歸、銀杏等制劑能抑制體內氧化應激反應，對糖尿病腎病(DN)大鼠有保護作用，臨床應用也有一定的效果，但仍不能抑制糖尿病患者腎損害的發生發展。白藜蘆醇(Res)是一類主要存在于葡萄、藜蘆等植物中的多酚類化合物，是紅葡萄酒中發揮心血管保護作用的主要功能因子〔2〕。研究發現，口服Res對環孢霉素A引起的腎毒性大鼠有保護作用〔3〕;Sharma等〔4〕給大鼠喂養 Res，能預防丙三醇所致的急性腎衰竭，并進一步發現與其抗氧化作用有關;Palsamy等〔5〕發現，通過對DN大鼠口服6 Res w，可以使尿蛋白量、血尿素氮和肌酐下降，但缺乏觀察光鏡下腎臟形態學變化以及電鏡超微結構的改變。本研究旨在探討腹腔注射Res對早期實驗性糖尿病大鼠腎臟損害的影響，從氧化應激的角度探討Res減輕糖尿病大鼠腎臟損害的機制，為臨床提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 白藜蘆醇購自天津尖峰天然產物有限公司，鏈脲佐菌素(STZ)購自美國Sigma公司，總抗氧化力(TAC)、巰基(SH)和丙二醛(MDA)試劑盒購自南京建成生物公司。血糖檢測采用美國強生血糖儀。雄性 Wistar大鼠，體重(256.2±9.4)g，由蘭州軍區總醫院動物實驗中心提供。

1.2 糖尿病動物模型制備、分組與處理 將Wistar大鼠隨機分三組，正常對照組(NC)9只、糖尿病組(DC)11只和白藜蘆醇治療組(Res 10 mg·kg－1·d－1)11只，三組大鼠喂以高糖高脂飼料(飼料組成:10.0%豬油，20.0%蔗糖，2.5%膽固醇，1.0%膽酸鹽，66.5%常規飼料)，體重達到400 g左右時，DC和Res組給予STZ(溶于新鮮配制的0.1 mol/L檸檬酸鹽緩沖液，pH4.5)，以30 mg/kg體重腹腔注射。72 h后尾靜脈采血測定空腹血糖，以血糖≥16.7 mmol/L者確定為糖尿病模型，大鼠成模后1 w開始腹腔注射給藥，NC和DC組給等量溶媒，用藥10 w后處死。所有大鼠自由飲水，給予高糖高脂飼料，每周稱體重和剪尾法測血糖，不使用胰島素及其他降糖藥。

1.3 觀測指標及檢測方法 用藥10 w時用代謝籠收集24 h尿液，測尿蛋白排泄量。剪斷右股骨動脈取血，測尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)，用比色法檢測丙二醛(MDA)、巰基(SH)、總抗氧化力(TAC)。大鼠處死后迅速取出左腎，去包膜稱重，計算腎臟指數(腎重量g/體重g×1 000);取小塊腎皮質用3%戊二醛固定，待電鏡觀察，并測定腎小球基底膜(GBMT)厚度，剩余部分制成10%的組織勻漿，待測MDA、SH和TAC。右腎置于4%多聚甲醛液中常規固定、石蠟包埋，用于常規HE染色觀察腎小球形態學改變，計算腎小球體積(MGV)。

2 結果

2.1 大鼠一般情況及血糖、體重變化 大鼠成模后出現多食、多飲、多尿、體重下降，皮毛枯黃，行動遲緩，反應遲鈍等表現，并逐漸加重。Res對糖尿病大鼠血糖無顯著影響。實驗中，DC組死亡2只，Res組1只。

2.2 各組大鼠血漿和腎皮質勻漿TAC、SH和MDA含量的變化 與NC組大鼠比較，DC組血漿和腎皮質中的MDA含量明顯升高，TAC、SH明顯降低(均P＜0.01)，Res能明顯降低糖尿病大鼠血漿和腎皮質MDA含量，升高TAC、SH水平(P＜0.01，P＜0.05)。見表1。

2.3 白藜蘆醇對糖尿病大鼠腎臟病理超微結構和功能的影響HE光鏡切片:DC組大鼠腎小球肥大，毛細血管內皮細胞腫脹，系膜區擴大(圖1)。電鏡下可見腎小球基底膜明顯增厚，足突觸合消失，系膜區增寬，系膜細胞增多，系膜外基質增多，腎小管上皮細胞腫脹(圖2)。與NC組比較，DC組血清尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、尿蛋白明顯升高;腎小球體積、腎臟指數和GMBT明顯增大、增厚(P＜0.01，P＜0.05)。見表2。Res治療組上述各指標均明顯改善，差異有統計學意義(P＜0.01，P＜0.05)。見表2。

表1 大鼠血清和腎皮質MDA、TAC、SH的含量(±s)

表1 大鼠血清和腎皮質MDA、TAC、SH的含量(±s)

與 NC組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;與 DC組比較:3)P＜0.05，4)P＜0.01，下表同

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表2 Res對糖尿病大鼠GMBT、MGV、腎臟指數、血清BUN、Cr、尿蛋白的影響(±s)

表2 Res對糖尿病大鼠GMBT、MGV、腎臟指數、血清BUN、Cr、尿蛋白的影響(±s)

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圖1 各組大鼠腎小球體積形態學改變(HE，×400)

圖2 各組大鼠腎小球基底膜形態學電鏡觀察(×10 000)

3 討論

本實驗用高脂高糖飼料培育肥胖大鼠，再以小劑量STZ腹腔注射誘導糖尿病，更符合成人2型糖尿病生理特點，糖尿病大鼠成模后11 w其血BUN、Cr及尿蛋白排泄水平升高，同時伴有腎小球肥大、系膜區增寬等一系列超微病理結構改變，說明已有糖尿病性腎臟損害，與文獻報道大鼠DN模型表現相一致〔6〕。高血糖誘發的反應性氧自由基參與糖尿病微血管并發癥的發生，在未出現腎臟組織學改變以前的糖尿病早期，體內脂質過氧化產物水平已明顯增高，抗氧化酶活性已明顯降低〔7〕。本研究結果表明，與正常大鼠比較，糖尿病大鼠血清和腎皮質中的脂質過氧化產物MDA含量明顯升高，TAC、SH明顯降低，說明糖尿病大鼠體內持續存在著全身和腎臟局部的氧化與抗氧化失衡。氧化應激可能直接或間接參與了糖尿病大鼠的腎臟損傷，在DN發病機制中起重要作用，那么抗氧化治療就應該能減輕或防止糖尿病腎損傷。

Res為良好的抗氧化劑，Hung等〔8〕研究證實Res對心肌缺血保護作用是通過其抗氧化作用實現的，其抗氧化作用強于維生素E和維生素C;King等〔9〕研究證實在人視網膜色素上皮細胞培養中，加入H2O2誘導形成的氧化應激狀態，Res能清除ROS并抑制其增殖;Kumar等〔10〕研究發現Res能明顯改善DM神經病變大鼠運動神經的傳導速度;Ates等〔11〕進一步研究發現Res對糖尿病神經病變保護作用與其抗氧化作用有關。本研究結果顯示，對實驗性糖尿病大鼠早期應用Res，在不干預高血糖的情況下，改善糖尿病大鼠全身和腎臟局部的氧化應激狀態可以顯著抑制糖尿病大鼠腎小球體積增大和毛細血管基底膜增厚，通過對超微病理學結構的改變，從而減少尿微量白蛋白的排泄、降低血BUN和Cr，改善腎功能。證明了Res對糖尿病大鼠早期腎損害的超微結構具有保護作用。Res能顯著改善糖尿病大鼠體內的氧化應激狀態，改善腎小球肥大，抑制腎小球基底膜增厚，減輕蛋白尿，從而起到防治糖尿病腎病的作用。

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2 Brownlee M.Biochemistry and molecular cell biology of diabetic complications〔J〕.Nature，2001;414(6865):813-20.

3 Chander V，Tirkey N，Chopra K.Resveratrol，a polyphenolic phytoalexin protects against cyclosporine-induced nephrotoxicity through nitric oxide dependent mechanism〔J〕.Toxicology，2005;210(1):55-64.

4 Sharma S，Anjaneyulu M，Kulkarni SK，et al.Resveratrol，a polyphenolic phytoalexin，attenuates diabetic nephropathy in rats〔J〕.Pharmacology，2006;76(2):69-75.

5 Palsamy P，Subramanian S.Resveratrol protects diabetic kidney by attenuating hyperglycemia-mediated oxidative stress and renal inflammatory cytokines via Nrf2-Keap1 signaling〔J〕.Biochim Biophys Acta，2011;1812(7):719-31.

6 傅松波，湯旭磊，賈麗云，等.苦參堿對糖尿病大鼠腎臟的保護作用〔J〕.中國老年學雜志，2010;30(3):376-8.

7 Brouwers O，Niessen PM，Ferreira I，et al.Overexpression of glyoxalase-I reduces hyperglycemia-induced levels of advanced glycation end products and oxidative stress in diabetic rats〔J〕.J Biol Chem，2011;286(2):1374-80.

8 Hung LM，Chen JK，Huang SS，et al.Cardioprotective effect of resveratrol，a natural antioxidant derived from grapes〔J〕.Cardiovasc Res，2000;47(3):549-55.

9 King RE，Kent KD，Bomser JA.Resveratrol reduces oxidation and proliferation of human retinal pigment epithelial cells via extracellular signal-regulated kinase inhibition〔J〕.Chem Biol Interact，2005;151(2):143-9.

10 Kumar A，Kaundal RK，Iyer S，et al.Effects of resveratrol on nerve functions，oxidative stress and DNA fragmentation in experimental diabetic neuropathy〔J〕.Life Sci，2007;80(13):1236-44.

11 Ates O，Cayli SR，Yucel N，et al.Central nervous system protection by resveratrol in streptozotocin-induced diabetic rats〔J〕.J Clin Neurosci，2007;14(3):256-60.