表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯對(duì)人胃癌MGC-803細(xì)胞增殖及凋亡的影響

鄒少娜，袁智子，胡倩云，戴賽君

(邵陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，湖南邵陽(yáng)422000)

綠茶中的茶多酚主要包括表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)、表沒(méi)食子兒茶素(EGC)、表兒茶素沒(méi)食子酸酯(ECG)及表兒茶素(EC)，其中EGCG的含量最為豐富，而且活性也最強(qiáng)，被認(rèn)為是21世紀(jì)最有前途的抗氧化劑和抗癌藥物之一［1］。細(xì)胞凋亡調(diào)控的失調(diào)是導(dǎo)致腫瘤形成的一個(gè)重要條件［2］。近來(lái)有研究表明，EGCG可在體內(nèi)外引起多種腫瘤細(xì) 胞的生長(zhǎng)抑制和凋亡［3，4］，但相關(guān)機(jī)制尚不十分明確。絲裂素活化蛋白激酶(MAPK)是細(xì)胞外信號(hào)引起細(xì)胞核反應(yīng)的共同通路，其家族成員細(xì)胞外激活蛋白激酶(ERK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)及p38分別在細(xì)胞增殖、凋亡方面起重要作用。2011年10月～2012年5月，為了明確EGCG對(duì)人胃癌細(xì)胞凋亡的影響以及其在臨床應(yīng)用的前景，我們觀察了EGCG對(duì)人胃癌MGC-803細(xì)胞的作用，并探討EGCG與MGC-803細(xì)胞MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人胃低分化黏液腺癌細(xì)胞株MGC-803(由中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心引進(jìn))，用含10%新生小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，在37℃、含5%CO2的飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑 EGCG(純度為 95%)、吖啶橙(AO)、溴化乙錠(EB)均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，小牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程有限公司，MTT購(gòu)自Amresco公司，凋亡細(xì)胞DNA Ladder檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責(zé)任公司，DNA Maker DL2000購(gòu)自大連寶生物工程有限公司，細(xì)胞裂解液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司，鼠抗人 ERK1/2、JNK、p38、磷酸化ERK(p-ERK)1/2、p-JNK、p-p38單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的IgG二抗和鼠抗人β-actin多克隆抗體購(gòu)自中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 EGCG作用后MGC-803細(xì)胞增殖抑制率的測(cè)算 采用MTT比色法檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，常規(guī)胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，培養(yǎng)6 h后隨機(jī)分為對(duì)照組(含0.9×104個(gè)細(xì)胞)，只加細(xì)胞懸液和培養(yǎng)基;EGCG組(為處理組)，細(xì)胞中分別加入EGCG 20、40、60、80、100、120 μmol/L，分別作用 24、48、72 h，接種于 96 孔平底培養(yǎng)板，每孔 180 μL(含 0.9 ×104個(gè)細(xì)胞);每個(gè)濃度每個(gè)時(shí)點(diǎn)設(shè)6個(gè)復(fù)孔。每孔加入 MTT 20 μL(5 mg/mL PBS)，4 h后終止培養(yǎng)，棄上清液，每孔加入 DMSO 200 μL，振蕩搖勻。采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定波長(zhǎng)為570 nm處吸光度值(A值)。細(xì)胞增殖抑制率=(1－處理組A值/對(duì)照組A值)×100%。采用藥物半數(shù)抑制濃度(IC50)計(jì)算軟件計(jì)算IC50值。

1.2.2 EGCG對(duì)MGC-803細(xì)胞凋亡的影響 ①細(xì)胞形態(tài)變化:采用AO/EB熒光染色法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，分為對(duì)照組(同 1.2.1)、EGCG 組(加入EGCG 100 μmol/L)［5］處理24 h，用0.25% 胰蛋白酶消化制成單細(xì)胞懸液，取95 μL的細(xì)胞懸液，加5 μL的AO/EB儲(chǔ)存液，混勻。吸一滴混合液點(diǎn)在潔凈玻片上后，封片，熒光顯微鏡下觀察并照相。②細(xì)胞內(nèi)DNA裂解片斷的檢測(cè):用DNA瓊脂糖凝膠電泳法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞分為對(duì)照組(同1.2.1)、EGCG 組(加入 EGCG 50、100、200 μmol/L)，作用24 h。用直接裂解法促M(fèi)GC-803細(xì)胞(1×107個(gè))快速高效裂解，經(jīng)特殊的硅基質(zhì)材料制備的離心吸附柱在一定的高鹽緩沖系統(tǒng)下高效專一地吸附其中的基因組DNA，溶于三羥甲基氨基甲烷/乙二胺四乙酸溶液(TE緩沖液)中，置2%的瓊脂糖凝膠，電泳2 h，在紫外線凝膠成像系統(tǒng)下顯影照相。③細(xì)胞凋亡率的測(cè)算:采用流式細(xì)胞術(shù)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞分為對(duì)照組(同 1.2.1)、EGCG 組(分別加入 EGCG 50、100、200 μmol/L)，作用 24 h。0.25%胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，1 000 r/min離心8 min，棄上清，加入4℃的70%乙醇1 mL固定，4℃冰箱內(nèi)過(guò)夜。檢測(cè)前用PBS洗滌2次，加 RNA 酶50 μL(濃度為 0.5 g/L)，37 ℃ 水浴30 min，加碘化丙啶(PI)50 μL，振蕩混勻，避光置冰箱30 min，300目尼龍網(wǎng)濾過(guò)，上機(jī)檢測(cè)，計(jì)數(shù)10 000個(gè)細(xì)胞，觀察細(xì)胞周期，采用WinMDI軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.2.3 MGC-803 細(xì)胞中 p-JNK、p-ERK、p-p38 的檢測(cè) 采用Western blot法。細(xì)胞分組同1.2.2中的③。EGCG作用24 h。收集細(xì)胞，加入150 μL的細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，提取蛋白，蛋白定量后取20 μg/孔行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，用5%脫脂奶粉封閉后，分別加入1∶1 000稀釋的一抗，4℃培育過(guò)夜，Tris-HCl緩沖鹽溶液加吐溫緩沖溶液(TBST)洗滌，加1∶2 000稀釋的二抗，37℃培育1 h，TBST洗滌2次。加入電化學(xué)發(fā)光試劑于暗室中自顯影，用凝膠成像儀進(jìn)行拍照記錄并進(jìn)行灰度分析。結(jié)果采用Gene Tools軟件分析目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。蛋白的相對(duì)表達(dá)量為目的蛋白的灰度值與內(nèi)參β-actin的灰度值之比。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量數(shù)據(jù)用ˉx±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組獨(dú)立樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EGCG對(duì)MGC-803細(xì)胞增殖的影響 EGCG對(duì)人胃癌MGC-803細(xì)胞的增殖有抑制作用，并呈時(shí)間和劑量依賴性效應(yīng)(P均＜0.05)。見(jiàn)圖1。其作用24 h 的 IC50為 99.5 μmol/L。由此確定濃度為50、100、200 μmol/L 的 EGCG 及24 h的作用時(shí)間作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的干預(yù)因素。

圖1 EGCG對(duì)MGC-803細(xì)胞增殖的影響

2.2 EGCG對(duì)MGC-803細(xì)胞凋亡的影響

2.2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué) 對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)飽滿，細(xì)胞質(zhì)呈綠色，核呈亮綠色，核形態(tài)規(guī)則;EGCG組細(xì)胞體積明顯縮小，核碎裂，染色質(zhì)凝集。

2.2.2 細(xì)胞DNA變化 對(duì)照組細(xì)胞DNA靠近加樣孔附近可見(jiàn)完整的基因組。EGCG組50 μmol/L的EGCG作用MGC-803細(xì)胞24 h時(shí)，未見(jiàn)DNA梯形條帶，劑量增至100、200 μmol/L時(shí)，出現(xiàn)明顯的階梯狀條帶。

2.2.3 細(xì)胞凋亡率 對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為3.0%±0.3%;EGCG 組:50、100、200 μmol/L 的 EGCG 作用后，細(xì)胞凋亡率分別為12.4% ±0.6%、27.4% ±1.3%、18.8% ±0.8%;兩組比較，P 均 ＜0.05。100 μmol/L的EGCG作用24 h后，細(xì)胞凋亡率最高(P＜0.05);藥物濃度增至 200 μmol/L 時(shí)，細(xì)胞凋亡率輕度下降(P ＜0.05)。

2.3 兩組細(xì)胞中p-JNK、p-ERK、p-p38表達(dá)變化兩組p-JNK、p-ERK、p-p38相對(duì)表達(dá)量見(jiàn)表1。

表1 兩組細(xì)胞中p-JNK、p-ERK、p-p38相對(duì)表達(dá)量比較(ˉx ± s)

3 討論

現(xiàn)已明確，大多數(shù)抗腫瘤藥物都可誘導(dǎo)敏感腫瘤細(xì)胞凋亡，并且其效能與腫瘤細(xì)胞在藥物誘導(dǎo)下發(fā)生細(xì)胞凋亡的內(nèi)在活性有關(guān)。因此有學(xué)者認(rèn)為［6］，多種化療藥物可以引起腫瘤細(xì)胞特定靶成分的損傷或功能喪失，從而傳遞信號(hào)引起細(xì)胞周期阻滯及進(jìn)入細(xì)胞凋亡的最終應(yīng)答，細(xì)胞凋亡可能是不同化療藥物殊途同歸的作用結(jié)果。EGCG具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用［7］，但是較高濃度的EGCG可直接導(dǎo)致細(xì)胞壞死［8］。有關(guān)EGCG誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制還不明確。

本研究結(jié)果顯示，EGCG可以抑制MGC-803細(xì)胞的增殖，并呈時(shí)間依賴性和濃度依賴性;EGCG處理后，MGC-803細(xì)胞可見(jiàn)典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變，如細(xì)胞體積縮小、胞質(zhì)濃縮、核內(nèi)染色質(zhì)邊集、凋亡小體形成;細(xì)胞內(nèi) DNA斷裂，呈階梯狀條帶(電泳)，說(shuō)明EGCG能夠誘導(dǎo)MGC-803細(xì)胞發(fā)生凋亡，且細(xì)胞處在晚期凋亡階段;細(xì)胞凋亡率明顯增加。本研究結(jié)果還顯示，當(dāng)EGCG濃度為100 μmol/L作用24 h時(shí)，細(xì)胞凋亡率最高;增至200 μmol/L時(shí)，細(xì)胞凋亡率輕度下降，可能是由于高濃度EGCG導(dǎo)致MGC-803細(xì)胞大量壞死所致。

為了進(jìn)一步探討EGCG誘導(dǎo)人胃癌MGC-803細(xì)胞凋亡的機(jī)制，我們選擇了MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)行研究。因?yàn)镸APK是細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的重要分子，廣泛參與細(xì)胞的分化、增殖、惡性轉(zhuǎn)化及凋亡作用［9］。經(jīng)典的ERK由促有絲分裂的刺激因素如生長(zhǎng)因子所激活，對(duì)細(xì)胞的增殖起關(guān)鍵作用;JNK和p38主要被細(xì)胞應(yīng)激和病理?yè)p傷信號(hào)所激活，介導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。有學(xué)者［10］研究發(fā)現(xiàn)，能夠通過(guò)激活ERK、JNK和p38誘導(dǎo)結(jié)腸癌HCT 116細(xì)胞凋亡，EGCG能夠通過(guò)抑制ERK、激活JNK和p38抑制胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移與血管形成;相反，短暫的JNK和p38活化可提供細(xì)胞存活信號(hào)，而持續(xù)的激活則誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因此，MAPK活化所導(dǎo)致的生物學(xué)效應(yīng)多種多樣，具有很大的細(xì)胞類型依賴性和刺激種類依賴性，同時(shí)也與MAPK調(diào)控不同的基因、作用的持久性有關(guān)。

本研究結(jié)果中，我們針對(duì)MAPK家族成員JNK、ERK、p38磷酸化形式及非磷酸化形式的特異性抗體，檢測(cè)了EGCG作用后以上激酶的表達(dá)水平及活化程度。激酶的磷酸化程度體現(xiàn)了其活化水平，在不同濃度藥物作用相同時(shí)間后，這幾種激酶的表達(dá)水平都沒(méi)有明顯的改變，其磷酸化的程度與對(duì)照組相比差異顯著。其中ERK的磷酸化受到明顯的抑制，而JNK、p38的磷酸化水平有一定的增加。因此我們認(rèn)為，EGCG抑制了ERK的活性，而在一定程度上提高了JNK、p38的活性。

綜上所述，EGCG能誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞凋亡，EGCG可能通過(guò)抑制ERK的活性，激活JNK、p38途徑來(lái)調(diào)控腫瘤細(xì)胞的凋亡。

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