豬巨細胞病毒gB基因的克隆與序列分析

劉興彩，尹燕博，徐守振，李吉達，張 毅，郭妍妍

（1.青島農業大學動物科技學院，山東 青島 266109；2.中國農業大學動物醫學院，北京 海淀 100193；3.青島澳蘭百特生物工程有限公司，山東 青島 266101）

豬巨細胞病毒（porcine cytomegalovirus，PCMV）屬于皰疹病毒科，β皰疹病毒亞科、巨細胞病毒（cytomegalovirus，CMV）屬的成員；近來有人認為將本病毒劃在玫瑰疹病毒屬中更為恰當［1］。其gB蛋白是CMV重要跨膜糖蛋白，在病毒與機體細胞膜的粘附、融合及病毒進入細胞和在細胞間的轉移起作用［2］；gB蛋白具有較好的免疫原性［3］，可誘導機體產生抗CMV的特異性免疫應答［4-5］。我們應用PCR診斷方法對全國11個省市地區豬場的100份臨床樣品進行了檢測［6］，篩選出4份PCR陽性病料，進行了gB基因的克隆與序列分析，為PCMV的分類地位和進化關系提供更多的信息。

1 材料與方法

1.1 病料 來自鄭州、福建、浙江金華和寧波病豬的肺臟。

1.2 菌株和載體 感受態細胞DH5α和pMD 18-T載體。

1.3 主要儀器和試劑 PCR擴增儀（LongGene MG96G），瓊脂糖（美國Promega公司），Taq DNA聚合酶（5U／μL）、dNTPs（25μmol／L）為寶生物工程（大連）有限公司產品，其他化學試劑均為國產分析純級。

1.4 引物 根據GenBank發表的PCMV AF268041序列，應用Primer Premier 5.0設計了PCMV gB全基因引物 g1：5′-ATGACAGTGAGCAGTCGGAA-3′；g2：5′-TCACACGTCCTCGGTGGATAG-3′，并由寶生物工程（大連）有限公司合成。

1.5 DNA的提取 按照文獻［6］中的提取方法進行提取。

1.6 gB基因PCR擴增 取出已分裝有PCR反應體系的離心管，加入2μL上述模板，混勻后稍離心，置PCR 儀中擴增：95℃ 5 min，94℃ 30s，62℃30s，72℃2min，30個循環，72℃ 10min.取 PCR產物5μL在10g／L瓊脂糖凝膠上電泳，置凝膠成像系統中觀察結果。

1.7 陽性克隆的鑒定與測序 回收PCR產物大小為2580bp，按照連接試劑盒說明書進行連接，然后將連接產物轉化到感受態細胞DH5α中，涂平板藍白斑篩選，將白色菌落接種到LB液體培養基中，置37℃劇烈震蕩培養12h后，進行PCR鑒定，將陽性菌株送寶生物工程（大連）有限公司測序。

1.8 序列分析 應用DNAStar軟件將測序結果與其他PCMV核苷酸和推測的氨基酸序列進行同源性分析，與皰疹病毒各亞科gB糖蛋白進行氨基酸序列分析，并與人皰疹病毒6型和7型（HHV-6和HHV-7）gB糖蛋白進行氨基酸序列比對，并構建進化樹；應用在線分析軟件TMHMM，ProtParam，Cysteine Connectivity Prediction Server和Prosite分別對gB糖蛋白進行跨膜預測，疏水性分析，半胱氨酸分析和潛在的N-糖基化位點分析。

2 結果

2.1 gB基因的PCR擴增結果 從4個不同來源的PCMV PCR陽性病料中，用PCMV gB全基因的特異性引物分別擴增出4個長度約為2580bp的條帶，與設計的長度一致（圖1）。

圖1 不同地區gB基因的PCR產物

2.2 PCMV gB基因序列同源性分析 對上述PCR產物進行了PCMV gB基因序列測定，獲得4個 PCMV gB 基 因 序 列 （NB200803，FJ200809，JH200810和ZZ200811），序列分析發現他們的同源性在98.1%～99.6%，差異性在0.3%～2.0%，與其他PCMV gB基因序列同源性在96.1%～99.7%，差異性在0.3%～4.1%，結果如圖2。

2.3 系統進化樹分析 遺傳進化分析發現，整個皰疹病毒屬明顯的分為3個亞科，而我們所獲得的來自4個不同地區的PCMV gB序列（圖中●所示）均屬于β皰疹病毒亞科，在β皰疹病毒亞科中，HHV-6和HHV-7與PCMV各株位于同一分支。另外，我們還發現PCMV推導的gB基因氨基酸序列出現分支，如圖3。

2.4 PCMV gB糖蛋白氨基酸序列與其他PCMV以及人皰疹病毒6型和7型gB糖蛋白氨基酸序列比較 推導的gB糖蛋白氨基酸序列有11個與二硫鍵形成有關的半胱氨酸（除NB200803在第320位：W→C和HN，湖南序列在第522位：C→Y），其中與HHV-6和HHV-7相比，共有9個潛在保守的半胱氨酸；潛在 N-糖基化位點（Asn-X-Ser or Thr）有17個，其中ZZ200811在196～198氨基酸處出現NNT→NYT，JH200810在563～565氨基酸處出現NNS→NDS以及ZZ200811、FJ200809、HN和55b（AF268040，Spain）在835～837氨基酸處出現NTT→NDS糖基化位點變異；在其氨基端包含一個疏水區（7～19），預測其為一個信號肽區域，應用Prot Param分析蛋白的親水性，得到的親水性最大平均數均為負值，說明具有很強的疏水性，蛋白跨膜預測發現跨膜區序列（730～752），膜外區（1～729）和膜內區（753～860），其跨膜區序列可能為跨膜錨定序列，與gB糖蛋白在膜上的錨定作用有關；潛在裂解位點是RYKR（439～442），無連續性堿性氨基酸插入，具有低致病性病毒分子特征。HHV-6和HHV-7的裂解位點分別是RRRR（396～399）和RKRR（393～396），它們均符合共有基序R-X-R／K-R規律。

從圖4可以很明顯的看出，黑色圓點比較密集有3個區域：第21～46位、第241～253位和第322～339位，這3個區域，變異比較集中，我們將其定為高變區。

3 討論

本試驗對來自4個不同地區的PCMV PCR陽性病料gB基因進行了克隆與序列分析，對推導的氨基酸進行了半胱氨酸、潛在N-糖基化位點、裂解位點及疏水性和跨膜分析，發現gB基因所編碼的gB糖蛋白這些生物特性類似于其他皰疹病毒gB糖蛋白［7］。此外，發現在皰疹病毒屬中，PCMV gB基因序列與HHV-6和HHV-7的ORFs 36～40序列同源性最高，如圖3所示，包括我們測序的4個樣本在內的PCMV毒株，與HHV-6和HHV-7同屬一個分支，說明它們之間具有較近的生物進化關系，但兩者又處在不同的兩個群，說明兩者存在差異。有報道稱，由于它們的細胞嗜性和細胞內DNA新陳代謝的顯著差異，而導致其生物進化關系復雜而又矛盾［8-9］，PCMV與HHV-6和HHV-7具有許多相似的分子生物學特性，它們的不同之處可能源于宿主細胞的選擇壓力［10］。

序列分析表明，我們測得的4個PCMV gB基因序列同源性在98.1%～99.6%，差異性在0.3%～2.0%，推導的氨基酸序列同源性在97.0%～99.3%，差異性在0.7%～3.1%，相對而言其序列變異不大。與其他PCMV gB基因序列同源性在96.1%～99.7%，差異性在0.3%～4.1%，差異性偏大的原因主要來源于湖南病料的PCMV gB基因序列。推導的氨基酸同源性在96.5%～99.7%，差異性在0.3%～3.1%，與β皰疹病毒亞科中其他常見病毒的同源性在25.9%～38.1%，由此說明CMV不同種屬間同源性較低。另外，我們發現在第21～46位這個高變區，HN（湖南）、ZZ200811、FJ200809和B6株（英國）的第33位由P→S，第42位由S→P，這說明它們之間發生了置換；第28位和29位由TA→ST，這是導致PCMV出現兩個分支的原因之一。該分支的出現說明其gB基因變異越來越明顯，并朝著兩個方向變異，而且該變異呈地域化發展的趨勢。

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