意向性運動療法對大鼠腦缺血再灌注損傷后GluR2和GRASP-1表達的影響

郭榮靜， 湯清平， 蔣 雯， 周芝文， 楊 杰

腦血管病是導致人類死亡的第二位疾病，其中缺血性腦血管病大約占全部腦血管病的80%［1］。腦卒中后存活者70%～80%遺留不同程度的功能障礙，很大程度上影響患者的生活質量，給國家和社會造成了沉重的經濟和社會負擔。

意向性運動療法［2］是指某一個體集中其注意力并竭盡全力完成某一動作，以達到某一預定目標的一種運動方式。Tang等［3］發現大腦中動脈梗死(MCAO)早期即給予大鼠意向性運動治療，能增加缺血期半暗帶區AMPA受體亞單位GluR2蛋白表達，但其具體調節機制仍不清楚。

GRASP-1(GRIP-associated protein-1)是2000年由Ye等［4］篩選出的蛋白，屬于Ras鳥嘌呤核苷酸交換因子(GEE)，且與GluR2、GRIP1存在共表達。最新研究發現［5］它通過介導突觸融合蛋白-13而將Rab4和Rab11連接起來，而從調節AMPA受體的運輸，且經證實GRASP-1對于維持樹突棘的形態以及AMPA的LTP是必需的。

本研究利用線栓法制備局灶性大腦中動脈缺血(MCAO)大鼠模型，在缺血后24h采用不同的康復手段，了解意向性運動療法干預對于大鼠行為學的影響，及動態觀察其對GluR-2以及GRASP-1的影響，揭示意向性運動療法的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物的準備 清潔級健康雄性SD大鼠192只，大鼠質量約為200～300g，鼠齡4～5個月(均購自中南大學湘雅醫學院實驗動物中心)。將192只試驗大鼠隨機分為兩組:TTC組(96只)以及免疫組化組(96只)。每組又分為4組:(1)大腦中動脈梗死模型組(MCAO):MCAO手術后將大鼠放于常規飼料箱內;(2)意向性運動療法(WM):MCAO手術再灌注后24h將大鼠放置于帶有人字梯的自制飼養箱內，食物及水置于箱頂蓋上;(3)飼養環境改變組(EM):MCAO手術再灌后24h將大鼠置于帶人字梯的自制飼養箱內，食物置放在飼養籠內;(4)一般康復組(CR):MCAO手術再灌后24h進行滾筒式網狀訓練，每日2次，每次30min，其余時間內將大鼠置于帶人字梯的自制塑料箱內，食物放在飼養籠內。所有食物均在上午9:30～10:00和下午3:00～3:30投放。各組再分成MCAO手術再灌后3d、7d、15d、30d 4 個小組。

1.2 訓練器材

1.2.1 飼料箱的制備 兩種類型的飼料箱:(1)常規飼料箱:箱底和側邊均為厚度約5mm的塑膠構成，大小約為40×30×18(高)cm，不銹鋼網格狀頂蓋的前部凹陷處放置食物及飲水瓶之上;(2)自制飼料箱:底部及側邊厚約5mm、高18cm的塑膠構成，其余周邊及頂蓋鐵制網格狀結構，大小約為38×28×32(高)cm，內放置自制人字型小梯8×10×22(高)cm。

1.2.2 自制滾筒式網狀訓練器 長1.0m、直徑約為60cm的圓形網狀訓練器，中間平均分為4個格，底座有一固定架，一端有一手搖柄，手搖按5r/min進行轉動訓練。

1.3 動物模型的制備 參考Zea Longa［6］的線栓法制備MCAO腦缺血模型。缺血2h后拔出，回抽尼龍線10mm，造成缺血再灌注。

1.4 行為學測量

1.4.1 神經功能缺損評分 在再灌注后清醒時、1d、3d、7d、15d、30d，根據改良的 Longa［6］六級標準評分法進行評分。2～5分為成功模型。

1.4.2 爬梯頻率 上午和下午各觀察大鼠1個小時的爬梯或側箱壁的次數，大鼠爬至箱頂或者梯頂計為一次，爬半梯計為0.5次。每日所得爬梯次數總和除以2為當天每小時的爬梯次數。

1.4.3 前后肢抓握功能評估 爬梯時前后肢抓握評分如下:前肢評分:爬梯子或者爬側壁時，抓握使用單側健側前肢為0分;使用雙側前肢，患肢抓握不穩者為1分;使用雙側前肢無明顯差別者為2分。后肢評分標準同前肢。

1.5 采用TTC染色測量梗死體積比 神經行為評分后，斷頭取腦組織;將全腦放置于-20℃冰箱冰凍30min后，自額極到枕極冠狀切片，每片厚約2mm，共切取5片。將腦片置于新鮮配制的2%TTC磷酸鹽緩沖液中，37℃下避光水浴孵育30min后將腦片從TTC溶液中取出，放入10%多聚甲醛中固定24h，用數碼相機拍照。采用Image pro plus 6.0圖像軟件系統掃描腦片，測量每個腦片各個層面的梗死面積值、左側半球面積值以及右側半球面積值。為了排除水腫和個體差異的影響，得到糾正后的一個相對值，即梗死體積比=［損傷對側半球總體積-(損傷側半球總體積-腦組織梗死體積)］/損傷對側半球總體積。

1.6 免疫組化 應用SABC法免疫組織化學染色。具體步驟:切片經過漂洗，置于新鮮配制的30%H202+純甲醇溶液中，浸入0.01mol檸檬酸緩沖液，5%BSA封閉抗原，室溫20min，分別滴加2%BSA稀釋的山羊抗小鼠GluR2多克隆抗體(1∶100 santa cruz公司)、山羊抗大鼠(1∶100 santa cruz公司)，最后DAB顯色。

1.7 結果觀察 在光學顯微鏡下觀察缺血半暗帶區GluR2和 GRASP-1陽性細胞。以 HPIAS-1000彩色病理圖像分析系統分析每個切片，計數陽性細胞數。每個指標每個時間點選取2張切片，每張切片選取缺血半暗帶區5個不重疊視野，高倍鏡下(×400)觀察每個視野內的陽性細胞數。

1.8 統計學處理 SPSS16.0統計軟件處理。數據處理均以均數±標準差()表示，所有數據均進行正態性及方差齊性檢驗;兩指標見分析采用雙尾Pearson’s相關檢驗，P＜0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 EM組、CR組、WM組爬梯頻率 再灌注后各時間點WM組大鼠爬梯次數均明顯多于CR組和EM組，再灌后7d、15d、30d具有統計學差異(均P ＜0.01)(見表1)。

2.2 4組神經缺損評分比較 再灌注后30d，WM組神經功能評分明顯低于MCAO組、EM組和CR組，與MCAO組相比差異具有統計學意義(見表2)。

2.3 EM組、CR組、WM組前后肢抓握功能再灌后15、30d，WM組與CR組以及EM組相比，前肢抓握功能改善明顯，差異有統計學意義(P＜0.05)。各組在再灌注各時間點相比，后肢的抓握功能差別無統計學意義(見表3、表4)。

2.4 4組之間TTC染色梗死體積比 經過TTC染色發現，大鼠大腦額葉、頂葉、顳葉皮質以及紋狀體可見明顯非紅染區域，為梗死灶。再灌注后15d、30d，WM組、EM 組、CR組與MCAO組相比較，梗死體積比均增大，以WM組增大的更明顯，差異有統計學意義(均P＜0.05)(見表5)。

2.5 4組之間不同時間點GluR2蛋白表達在缺血半暗帶區，再灌注后3d、7d、15d各組之間未見明顯差異。再灌注后30d WM組GluR2陽性細胞表達明顯增加，與MCAO組相比具有統計學意義(P＜0.05)(見表6、圖1)。

2.6 4組之間不同時間點GRASP-1蛋白表達在缺血半暗帶區，再灌注后3d、7d、15d各組之間未見明顯差異。再灌注后30d WM組GRASP-1陽性細胞表達明顯增加，與MCAO組比較具有統計學差異(P ＜0.05)(見表7、圖2)。

圖2 30d時各組大鼠缺血半暗帶GRASP-1蛋白表達(×400)

2.7 相關分析 通過 Pearson’s相關檢驗，GluR2與GRASP-1蛋白表達之間的相關系數為0.678，具有統計學意義(P ＜0.01)，說明 GluR2 與GRASP-1具有相關性。

表1 EM組、CR組、WM組爬梯頻率比較(，n=12)

表1 EM組、CR組、WM組爬梯頻率比較(，n=12)

與同時間點的EM組及CR組比較*P＜0.01

再灌時間(d)組別3715 30 EM組CR組WM組3.22 ±0.79 2.73 ±0.96 3.47 ±0.84 4.19 ±0.31 4.06 ±0.14 8.38 ±0.17*4.68 ±0.34 4.30 ±0.17 10.72 ±0.37*5.70 ±0.53 5.58 ±0.25 12.15 ±0.77*

表2 4組神經功能缺損評分比較(，n=12)

表2 4組神經功能缺損評分比較(，n=12)

與MCAO組比較*P＜0.05

再灌時間(d)組別1h 24h 3d 7d 15d 30d MCAO組EM組CR組WM組3.08 ±0.29 3.00 ±0.60 3.08 ±0.29 3.08 ±0.40 2.08 ±0.29 2.17 ±0.39 2.08 ±0.29 2.17 ±0.39 1.92 ±0.29 1.83 ±0.39 1.83 ±0.39 1.75 ±0.45 1.75 ±0.45 1.58 ±0.51 1.67 ±0.49 1.50 ±0.52 1.50 ±0.52 1.33 ±0.49 1.41 ±0.51 1.25 ±0.45 1.33 ±0.49 1.08 ±0.79 1.17 ±0.72 0.75 ±0.62*

表3 EM組、CR組、WM組前肢抓握功能(，分，n=12)

表3 EM組、CR組、WM組前肢抓握功能(，分，n=12)

與同時間點的EM組及CR組比較*P＜0.05

組別再灌時間(d)3 7 15 30 EM組CR組WM組0.73 ±0.47 0.55 ±0.52 0.67 ±0.49 0.91 ±0.30 0.83 ±0.39 0.91 ±0.29 1.33 ±0.49 1.25 ±0.45 1.75 ±0.48*1.52 ±0.46 1.46 ±0.38 1.92 ±0.29*

表4 EM組、CR組、WM組后肢抓握功能(，分，n=12)

表4 EM組、CR組、WM組后肢抓握功能(，分，n=12)

組別再灌時間(d)3 7 15 30 EM組CR組WM組0.83 ±0.39 0.75 ±0.45 0.92 ±0.38 1.18 ±0.40 1.17 ±0.58 1.17 ±0.71 1.83 ±0.39 1.83 ±0.39 1.91 ±0.30 1.92 ±0.29 1.92 ±0.29 2.00 ±0.00

表5 4組之間TTC染色梗死體積比(，n=6)

表5 4組之間TTC染色梗死體積比(，n=6)

與MCAO組比較*P＜0.05

組別再灌時間(d)3 7 15 30 MCAO組EM組CR組WM組0.20 ±0.10 0.16 ±0.25 0.11 ±0.15 0.14 ±0.10 0.13 ±0.19 0.17 ±0.13 0.18 ±0.14 0.12 ±0.08 0.08 ±0.18 0.17 ±0.18 0.15 ±0.14 0.30 ±0.16*0.08 ±0.14 0.25 ±0.25 0.21 ±0.21 0.29 ±0.78*

表6 各組大鼠缺血半暗帶區GluR2蛋白表達的比較(，陽性細胞數，n=6)

表6 各組大鼠缺血半暗帶區GluR2蛋白表達的比較(，陽性細胞數，n=6)

與MCAO組比較*P＜0.05

組別再灌時間(d)3 7 15 30 MCAO組EM組CR組WM組72.60 ±2.52 72.78 ±2.34 72.63 ±3.45 72.90 ±3.28 73.03 ±4.08 73.27 ±3.50 73.23 ±4.08 73.21 ±3.48 73.93 ±1.63 74.03 ±3.38 74.00 ±3.58 74.23 ±3.07 75.17 ±1.45 76.87 ±1.14 76.50 ±2.23 78.27 ±1.94*

表7 4組大鼠缺血半暗帶區GRASP-1蛋白表達的比較(，陽性細胞數，n=6)

表7 4組大鼠缺血半暗帶區GRASP-1蛋白表達的比較(，陽性細胞數，n=6)

與MCAO組比較*P＜0.05

組別再灌時間(d)3 7 15 30 MCAO組EM組CR組WM組85.50 ±5.47 85.94 ±7.12 85.55 ±5.01 86.11 ±6.55 86.50 ±1.28 86.67 ±5.12 86.55 ±8.53 86.72 ±8.53 87.00 ±1.09 87.67 ±1.46 87.33 ±6.63 88.27 ±1.10 88.00 ±2.42 88.94 ±1.74 88.89 ±1.73 91.28 ±2.26*

3 討論

運動訓練通過改變突觸的結構和功能的可塑性影響學習記憶以及改善神經功能恢復［7］。有研究［8］表明成年腦損傷可導致與損傷側腦組織毗鄰的腦區發生適應性可塑性改變，康復訓練通過改變鄰近損傷區域以及對側半球神經元的可塑性，從而改善癱瘓的程度。功能磁共振［9］發現上肢功能完全或者部分恢復的患者，大腦內相對應區域的皮質功能發生重組。國際上公認的卒中后康復模式可分為:隨意運動、非隨意運動以及強迫運動。在腦損傷后，這些康復模式改善認知功能以及神經功能恢復［10～12］。

Zheng等［13］研究不同康復模式對缺血再灌注后大鼠神經功能恢復以及BDNF的影響，該研究表明隨意運動組、非隨意運動組以及強迫運動組與制動組相比，更能提高海馬BDNF的濃度以及促進運動功能的恢復。有研究發現早期強制患肢過度運動可引起腦損傷，其機制可能是早期強制使用患側肢體增加NMDA介導的興奮性毒性作用，導致鈣離子大量內流，從而使細胞膜通透性增加，加重腦組織損傷。而大部分的研究發現腦梗死后早期逐漸增加運動的強度不增加梗死體積，不損害感覺運動功能，對運動功能恢復有利。

在本實驗WM組和EM組均屬于隨意運動，CR組屬于強迫運動。因為在腦梗死的早期，由于大鼠肢體癱瘓，以及不愿意活動的情緒障礙，不利于神經功能的康復。WM組用食物和水誘導大鼠爬梯，大鼠在饑餓和口渴時必須運動，而EM組則將爬梯僅作為一種娛樂活動，CR組每日則進行定時定量的強迫運動，強迫運動后大鼠更不愿意自己主動運動，經過30d的各種形式的康復訓練后，WM組在神經功能評分以及前肢抓握功能方面較其他3組得到較好的恢復，這進一步說明隨意運動能促進神經功能恢復。

Humm等［14］研究亦發現在缺血再灌注后的7d內早期過度使用患側肢體導致大鼠感覺運動皮層區神經元損害擴大，在很大程度上干擾神經功能重建。Risedal［15，16］等研究發現在缺血再灌注 24h 即開始的特定運動可以使梗死體積增大。

本實驗中發現再灌注后15d、30d時WM組較其他組梗死體積比增大。其可能原因為WM組大鼠必須通過大量的運動來獲取食物及水，且缺血再灌注24d后即開始鍛煉，結合既往的文獻，推測體積增大與早期即給予高強度的訓練有關，在以后的實驗中應定時將大鼠放在自制飼養箱內進行康復訓練，而其余時間將其放在普通飼養籠中，從而減少運動的強度。同時我們的實驗發現早期給予高強度的意向性運動療法，一方面能改善大鼠的神經功能;另一方面卻使梗死面積增大。既往亦有類似研究［17］發現梗死體積和神經功能的恢復無明確相關性，其可能的原因是在腦卒中的早期，神經功能評分反映的是缺血中心區以及缺血半暗帶的損傷，即病灶的部位和大小;而隨著灌注的恢復，缺血半暗帶的腦功能發生重組，神經功能評分反映的是腦功能的可塑性和重組［18］。因此，雖然組織化學損害表現為加重，但是癥狀可能會減輕。臨床資料也［19，20］發現癥狀和病灶的演化無明確相關性。所以我們推測梗死面積和神經功能的恢復可能無直接相關。

1955年Vrba［21］首次研究發現運動訓練可以影響谷氨酸系統。1999年Bland［22］發現肢體隨意運動后，谷氨酸水平在紋狀體、海馬以及感覺運動皮層均增加。2005年Dietrich［23］給予大鼠隨意運動一個月后，發現 GluR1、SAP-97、GRIP-1、GluR2/3、PSD-95 在大腦皮層表達均增加。2007年Tang等［3］在研究意向性運動療法對大鼠局灶性腦缺血不同時期的影響時發現，在腦缺血再灌注30d后GluR2蛋白在缺血半暗帶的表達增加，15～30d時，GluR1 mRNA表達上調，GluR3、GluR4表達未見明顯變化。2010年，Caroline等［24］研究發現在經過不同時間的訓練后GluR2亞基的表達不同，經過30d的訓練其表達大量增加，并認為這些受體在大腦的可塑性中起著重要作用。2011年侯德仁等［25～27］發現意向性運動療法可以促進MCAO大鼠神經功能缺損的恢復，可能與缺血周圍腦組織GFAP、SYP、NT-3和GAP-43的表達有關。

AMPA受體的GluR2/3亞單位C末端可以直接與GRIP1相連，GRASP-1可以特異性地與GRIP1的第7個結構域相互作用，特異地表達在所有神經組織中。2010年 Hoogenraad［5］發現 GRASP-1蛋白表達水平的降低可以減少生物素標記上的GluR2亞基，并證實了在海馬神經元GRASP-1和GluR1/2存在共表達。研究發現敲除GRASP-1基因后樹突中的循環內體的數量只有原來的0～10%。并發現其定位于 Rab4陽性的早期內體循環系統中，作為Rab4效應器，與Neep21競爭性的結合syntaxin 13，GRASP-1表達增加可以使syntaxin 13從Neep21/EEA1/Rab5陽性結構中分離，促使Rab4/Rab11在神經元的共表達增加，從而使內體循環至胞膜?？傊珿RASP-1在AMPA受體循環、維持突觸可塑性以及樹突的形態中起著重要作用;在分子水平發現，作為其可連接Rab4和Rab11，調節AMPA受體再循環。

本實驗研究結果顯示:在局灶性腦缺血亞急性期，意向性運動療法可能通過誘導大鼠腦缺血再灌注損傷后缺血半暗帶區GRASP-1蛋白表達上調，增加GluR2表達，增強突觸傳遞效能，提高突觸可塑性。

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