MCAO大鼠梗死灶對側皮層Nogo-A的動態變化及電針干預

梁艷桂， 譚 峰， 陳 杰， 吳海科， 萬賽英王海僑， 王學文， 黃勛福， 韓福蘭， 吳 強

目前，國內外急性腦梗死(acute cerebral infarction，ACI)的研究主要集中在如何減輕梗死灶局部神經損傷和增強周圍組織的代償能力方面，而對遠隔病灶部位繼發性損害極少關注。研究證實，ACI損害并不限于梗死灶局部，遠隔部位也發生繼發性損害，并阻礙神經功能的恢復［1，2］。我們的前期研究發現，Nogo-A參與ACI丘腦繼發性損害，電針對高血壓腦缺血損傷的保護作用可能與其下調神經抑制因子neurocan-mRNA與Nogo-A表達等機制有關［3～5］。但電針對ACI遠隔損害有無影響?對Nogo-A抑制信號傳導有何作用?能否通過調控Nogo-A抑制信號傳導通路蛋白表達來減輕腦梗死遠隔損害，促進CNS修復?這些問題還不清楚，國內外亦未見翔實的研究報道。本實驗采用改良Zea Longa法制備大鼠大腦中動脈的缺血再灌注模型，應用免疫組織化學法及透射電鏡技術觀察電針對腦缺血再灌注大鼠腦梗死灶對側皮層不同時期Nogo-A表達、細胞超微結構的影響，探討電針促進神經功能修復的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 SPF級雄性SD大鼠130只，重(240±40)g，月齡3個月，由廣東省實驗動物中心提供，普通顆粒飼料和自來水喂養，室溫控制在15℃ ～24℃。實驗動物使用許可證號SCXK(粵)為2008-0002，實驗動物質量合格證號為0065739。采用隨機數字表法分為5組:電針組(30只)、假穴位組(30只)、模型組(30只)、假手術組(30只)和空白組(10只)。

1.2 試劑及儀器 兔抗大鼠 Nogo-A:Santa Cruz Biotechnology公司;SABC顯色試劑盒:武漢博士德生物工程有限公司;多導生理記錄儀:德國HU GO SACHSEL EKTONIK;JEM1200-EX型透射電鏡:日本電子公司;顯微鏡:日本Olympus Ixto倒置顯微鏡;全自動圖像分析儀:德國Kontron IBAS 2.0全自動圖像分析系統;JVC ky-F30B 3-CCD彩色圖像攝錄輸入儀。

1.3 MCAO模型制作 采用改良的Zea Longa法［6］制備左側MCAO模型。用3%戊巴比妥鈉(0.2 ml/100g)腹腔麻醉后，經頸部正中切口逐層分離組織，暴露和分離左側頸總動脈(common carotid artery，CCA)、頸外動脈(exterior carotid artery，ECA)和頸內動脈(interior carotid artery，ICA)，結扎并游離ECA及其分支，沿ICA向下分離翼腭動脈(pterygopalatine artery，PPA)。于ECA殘端起始部剪一小口，輕輕插入制備好的尼龍線，快到達PPA時，用鑷子輕輕夾住PPA起始部，讓尼龍線順利進入ICA顱內段，尼龍線插入深度以CEA分叉處開始計算約為(18±0.5)cm。縫合皮膚。再灌注時外拉尼龍線使其球端回到ECA內即可恢復ICA和MCA的血供。術后單籠喂養觀察(模型成功標準:參照文獻［6］的方法，MCAO制模成功的標志為:大鼠在線栓后即出現左側Horner綜合征(左側瞳孔縮小)，麻醉清醒時出現右側前肢或前后肢癱瘓。在規定缺血時限內(術后2～3h)未出現右側肢體癱瘓或已經死亡的大鼠被剔除。再灌注成功的標準為線栓拔出后ICA和Willis環無血栓和出血)。動物死亡及時補充，保證每組動物數量。假手術組:只作頸總動脈分離，然后縫合皮膚，不作線栓處理。模型組:僅作MCAO缺血再灌注模型處理。電針組:缺血再灌注后每天給予電針治療，按文獻［7］方法定位大鼠督脈“百會、大椎”穴位。假穴位組(30只):缺血再灌注后每天選取督脈“百會、大椎”穴左側旁開1cm處作電針治療。空白組(10只):不作任何處理，一般喂養。

1.4 針刺及處理方法 選用30號1寸毫針，沿皮斜刺“百會、大椎”兩穴，進針深度2～3mm。針柄接至G68051A針灸治療儀電極上，復流后，通電留針30min，采用連續波，頻率為3Hz，強度3V，以肢體抖動、但使動物不掙扎、嘶叫為度。電針1次/d，連續28d。假穴位組取督脈“百會、大椎”穴旁開1寸處作電針治療，方法同上。假手術組、模型組、電針組和假穴位組大鼠分別于術后1d、7d、28d 3個不同時間點用3%戊巴比妥鈉(0.2ml/100g)麻醉，經左心室向主動脈插管，灌注4℃生理鹽水100ml，然后換用4℃ 4%多聚甲醛緩沖液100ml灌注，灌注后的動物開顱取腦，放于4%多聚甲醛溶液里浸泡固定24h。空白組大鼠則觀察28d后用同樣方法灌注固定后取腦檢測。

1.5 觀察項目及檢測方法

1.5.1 Nogo-A采用免疫組織化學染色法(SABC法)。參照《大鼠腦立體定位圖譜》［8］取缺血中心的大腦進行石蠟包埋，冠狀切片，每個時間點的每只大鼠取5張切片，片厚3μm，按免疫組織化學染色步驟操作。對照實驗:用PBS代替一抗進行實驗。均采用陽性細胞記數法，在400倍光鏡下選取梗死對側皮層5個互不重疊的視野，每個時間點共計15個視野，用Kontron IBAS 2.0高清晰彩色病理圖文分析系統，統計在400倍光鏡下每個視野的單位面積陽性細胞數，將所得均數作為各組每個時間點的陽性細胞數。

1.5.2 神經元細胞形態及超微結構觀察 分別于1d、7d及28d 3個時間點，從模型組、電針組和假穴位組中各隨機抽取1只大鼠用3%戊巴比妥鈉(0.2ml/100g)腹腔麻醉，迅速開胸，暴露心臟，左心室主動脈插管，快速灌注生理鹽水100ml，然后用含4%多聚甲醛、2.5%戊二醛的磷酸鹽緩沖液(PBS)100ml灌注固定30min。斷頭取腦，分別從左側缺血區大腦皮層及對側皮層相應部位各取組織塊約1×1 ×1mm，放入4%多聚甲醛、2.5%戊二醛的0.1mol/L PBS溶液進行前固定3～4h;按常規電鏡樣品制備程序漂洗、脫水、浸透及環氧樹脂包埋。超薄切片后，將切片撈至載網上干燥。透射電鏡下觀察切片上細胞形態及超微結構的改變并攝片。

1.6 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件進行分析。所有計量資料均用均數±標準差()表示，組間比較采用單因素的方差分析。檢驗水準取α=0.05，以 P＜0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 電針對腦缺血再灌注大鼠不同時間點梗死灶對側皮層神經元細胞形態及超微結構的影響空白組和假手術組大鼠腦皮層結構分明，神經元、膠質細胞及毛細血管等超微結構正常。模型組和假穴位組各時間點大鼠腦梗死灶對側皮層呈現神經細胞胞體腫脹、細胞器水腫、核染色質輕度溶解、毛細血管內皮細胞腫脹、管腔狹窄等輕度病理改變，以缺血再灌注后第7天最明顯，28d明顯減輕。上述病理改變均較同期患側皮層缺血區病變程度明顯減輕，且不足以引起支配側肢體神經功能缺失。電針組大鼠腦梗死灶對側皮層神經元、膠質細胞及毛細血管等超微結構的改變均較同期模型組、假穴位組減輕。

2.2 電針對腦缺血再灌注大鼠不同時間點梗死灶對側皮層Nogo-A表達的影響 免疫組織化學顯示空白組和假手術組腦梗死灶對側皮層Nogo-A陽性細胞呈基礎表達，兩組間比較差異無統計學意義(P ＞0.05)。模型組在 I/R 后1d、7d、28d各時間點大鼠腦梗死灶對側皮層見Nogo-A陽性細胞表達反應性上調，7d最明顯，28d后明顯下降。電針組I/R后1、7d各時間點大鼠腦梗死灶對側皮層Nogo-A陽性細胞表達量均低于同期模型組和假穴位組，差異有統計學意義(P＜0.05);假穴位組與模型組同期對比差異無統計學意義(P＞0.05)(見表1)。

表1 各組大鼠腦梗死灶對側皮層Nogo-A陽性細胞數目比較(，n=9，個/cm2)

表1 各組大鼠腦梗死灶對側皮層Nogo-A陽性細胞數目比較(，n=9，個/cm2)

與模型組、假穴位組同一時間點比較*P＜0.05

腦缺血再灌注不同時間點Nogo-A陽性細胞數組別 例數1d 7d 28d空白組假手術組模型組電針組假穴位組F值P值99999---1.91 ±0.35 5.91 ±1.85 4.16 ±1.11*5.47 ±1.85 18.458 0-2.38 ±0.48 6.47 ±1.71 4.84 ±0.99*6.07 ±1.94 15.411 0 2.09 ±0.46 1.98 ±0.55 3.44 ±1.19 2.27 ±0.97 2.93 ±2.25 2.036 0.129

3 討論

目前針對腦梗死的臨床和實驗研究主要集中在梗死灶及缺血半暗帶神經組織的保護和修復，但療效往往不盡人意。最近研究證實，ACI損害并不限于梗死灶局部，晚期由于遠隔部位與梗死灶相聯系的神經纖維出現華勒變性，導致遠隔部位不可逆的進行性萎縮或變性，稱之為遠隔損害(secondary damage)。根據遠隔損害的發生是腦梗死康復效果不理想、致殘率高的重要原因之一，從而提出卒中治療的新靶點［1，2］。

有關遠隔梗死灶的腦組織發生繼發性損害的確切機制尚未完全闡明，已有研究提示包括以細胞凋亡引起的遲發性細胞死亡、軸突退行性改變、神經營養障礙、神經生長抑制因子增加、局部腦血流量減少、神經遞質調節失衡和蛋白合成抑制等為中心在內的多種因素參與其中［9～11］。

動物實驗發現，大鼠大腦中動脈閉塞后遠隔部位小腦皮質Nogo-A的表達明顯升高，并發生繼發性免疫損害［12］。腎血管性高血壓大鼠(stroke-prone renovascular hypertensive rats，RHRSP)大腦皮層梗死后1～4w，梗死灶同側丘腦的繼發性損害與神經抑制因子Nogo-A增加有關，Nogo-A拮抗劑NEP1-40通過可對抗這種繼發性損害而改善神經功能［5］。進一步地，我們在動物實驗中也發現，RHRSP大腦皮層梗死后1～4w，梗死灶同側丘腦、海馬、中腦黑質及對側脊髓前角神經元等遠隔部位繼發性損害與神經抑制因子 neurocan-mRNA 和 Nogo-A 有關［2～5］。

抗Nogo-A抗體能明顯地增加未損傷的感覺運動皮層(SMC)來源的中線交叉的皮質脊髓束，并發出新的投射到患側支配區，促進患肢功能恢復［13，14］。這表明Nogo-A參與ACI遠隔損害，抑制神經再生。

本實驗采用免疫組織化學法及透射電鏡技術觀察電針對腦缺血再灌注大鼠腦梗死灶對側皮層不同時期Nogo-A表達、細胞超微結構的影響。結果顯示，缺血再灌注后第1天，大鼠腦梗死灶對側皮層可見Nogo-A陽性細胞表達呈反應性增多;第7天達到高峰，28d大致恢復到基礎水平。透射電鏡觀察到腦缺血再灌注后各時間點大鼠腦梗死灶對側皮層亦出現神經細胞胞體腫脹、細胞器水腫、核染色質輕度溶解、毛細血管內皮細胞腫脹、管腔狹窄等輕度病理改變。

上述病變程度均輕于病灶側，且不足以引起支配側肢體神經功能損傷。這提示與梗死灶壞死神經元有相關聯系的對側皮層神經元軸突也出現斷裂、腫脹，隨后發生髄鞘脫失、軸索溶解等華勒變性，同時伴隨相關部位神經元丟失。此病理改變是否與Nogo-A動態變化相關?我們發現，電針治療后，大鼠腦梗死灶對側皮層Nogo-A的表達均低于同期假穴位組和模型組(P＜0.05)。透射電鏡顯示電針組腦組織神經元、膠質細胞、毛細血管等超微結構的缺血性損傷均較假穴位組、模型組同期明顯減輕。

由此可推測，Nogo-A參與梗死灶對側皮層繼發性損害，電針可減輕遠隔損害與部分阻遏Nogo-A抑制性信號傳導通路蛋白表達密切有關。其機制可能是電針在腦缺血早期通過穩定細胞內外離子濃度、抑制Ca2+內流、穩定神經遞質的濃度等多種方式調節突觸信號的傳遞，維持神經元的存活和促進神經突觸的生長及抑制膠質瘢痕形成。而在后期少突膠質細胞主要以合成抑制因子和損傷因子為主，電針以雙向調節的作用保護梗死灶對側皮層少突膠質細胞及抑制少突膠質細胞的激活，減少突觸抑制因子Nogo-A的合成和釋放，阻斷與其相關的抑制信號傳導通路，從而減輕遠隔部位的繼發性損害。這為電針更好地治療ACI患者、減輕ACI遠隔損害、提升康復療效提供了一定的理論依據。

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