特異性激活SHH通路對急性腦缺血大鼠血管再生影響

朱美霖， 白宏英， 曾志磊， 張沛琳

腦缺血后血管再生正在受到越來越多的關注，研究表明腦缺血后血管再生能夠盡快恢復缺血區的血供，挽救瀕臨死亡的神經元［1，2］。腦缺血后，缺血組織釋放細胞因子動員內皮祖細胞，使其歸巢并通過自身的分化、增殖形成新生血管。新生血管可以為組織細胞提供營養物質和氧，進而改善局部血供，縮小梗死灶［3］，有助于腦缺血患者缺損的神經功能恢復。Sonic hedgehog信號通路(SHH)與血管再生有著密切的聯系，Kusano［4］等發現糖尿病大鼠外周神經病變中加入外源性SHH可以誘導神經血管生成。SHH信號通路可影響眾多血管新生因子，如VEGF和CD105等，從而調控血管生成。VEGF是血管生成的主要調控因子，CD105是血管再生所必需的，其表達與新生血管內皮細胞相關。既往對SHH信號通路對腦缺血后血管再生的研究甚少，本實驗擬用purmorphamine激活SHH信號通路，以探究SHH信號通路激活對腦缺血后血管再生因子的影響，為腦缺血治療提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 動物分組及給藥方法 健康成年雄性SD大鼠108只，清潔級，體重280～350g(由河南省實驗動物中心提供)，給予標準的飼料，自由進食進水。SD大鼠隨機分為3組，即A組:假手術組(n=12);B組:模型組(n=48);C組:給藥組(n=48)。其中B組和C組按時間分為4個亞組即6h、12h、24h、48h，每亞組12 只。C 組于術后按0.69/mg給予purmorphamine溶液腹腔注射，A組和B組于術后給予等劑量的DMF溶液注射。

1.2 藥品與試劑 purmorphamine粉劑(T.R.C，CAS:483367-10-8)購自上海凱試公司。使用前先用DMF溶解，再用PBS溶液稀釋。VEGF兔抗鼠多克隆抗體、CD105兔抗鼠多克隆抗體購自美國SANTA CRUZ。SP9000試劑盒、DAB試劑盒購自北京中杉生物工程公司。PCR試劑盒、內參β-actin、DEPC水、逆轉錄試劑盒、Trizol均購于北京全式金生物技術有限公司。

1.3 缺血模型的制備 參照Zea longa［5］等報道的線栓法制作SD大鼠永久性大腦中動脈缺血模型。假手術組僅分離頸總動脈及其分支，并不插入線栓和結扎。術中大鼠體溫保持37℃。于大鼠清醒1h后進行神經功能評分，評分標準參照Zea longa 5分制評分標準。0分，無任何神經缺損癥狀;1分，不能完全伸直對側前爪;2分，向對側轉圈;3分，向對側傾倒;4分，不能自由行走;5分，死亡。其中評分1～4分入選后續試驗，如在實驗過程中有死亡或者不符合要求的大鼠，取同批次大鼠補足數量。

1.4 標本制備 10%水合氯醛麻醉，4%多聚甲醛心臟灌洗固定24h備用。石蠟包埋后連續切片，制備成4μm厚度切片。

1.5 免疫組化測定缺血半暗帶區域VEGF和CD105的表達 采用SP法，按照說明書操作。每張切片隨機選取10×40視野5個，應用圖像分析系統進行光密度分析。

1.6 RT-PCR檢測缺血半暗帶內PTCH-1 mRNA的表達情況 10%水合氯醛麻醉大鼠，斷頭取腦，液氮冷凍后放置-80℃冰箱保存。按試劑盒說明書提取出腦組織總RNA，逆轉錄合成cDNA后進行擴增。擴增上游引物為5’-AAATGCTGAATAAAGCCGAAGT-3’，下游引物為 5’-GTGCCACCCACAATCAACTC-3’，擴增條件如下:94℃預變性2min，1 個循環;94℃變性 30s，58℃退火 30s，72℃延伸2min，共計35個循環;72℃延伸6min。實驗中以β-actin作為內參。PTCH長度為199bp，擴增后得到所需目的基因經過電泳鑒定后采用圖像分析系統進行半定量分析，目的基因PTCH-1的表達量與β-actin的DNA條帶灰度比值進行計算。

1.7 統計學分析 采用SPSS17.0統計軟件，實驗數據以均數±標準差()表示。組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗，取α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 PTCH-1 mRNA表達情況 與A組比較，B組和C組PTCH-1 mRNA表達增高。差異具有統計學意義(P﹤0.05)。B組和C組缺血半暗帶區域的PTCH-1 mRNA表達于腦缺血6h后開始升高，24h達高峰，之后有所下降但仍維持在較高水平。但與C組各時間點PTCH-1 mRNA與B組相比較表達顯著增高，組間比較差異具有統計學意義(P＜0.05)(見表1)。

2.2 VEGF表達情況 A組中大鼠腦組織中VEGF存在少量陽性細胞表達，B組和C組6h表達量開始增加，于48h表達最為顯著。陽性表達區域主要存在于皮層下區和海馬區的梗死灶周圍。C組與A組、B組相比較各時間點陽性細胞數表達明顯增多，差異具有統計學意義(P＜0.05)(見表2、圖1)。

2.3 CD105測定結果 A組CD105弱表達，B組于腦缺血后6h表達開始增高，且隨著時間增加表達逐漸增高，C組與B組各時間點相比較CD105表達明顯增多，差異具有統計學意義(P＜0.05)(見表3)。

表1 大鼠腦組織中各個時間點PTCH-1mRNA表達(n=6，)

表1 大鼠腦組織中各個時間點PTCH-1mRNA表達(n=6，)

與A組相比*P＜0.05;與B組相比△P＜0.05

組別/時間點6h 12h 24h 48h A組B組C組0.085 ±0.006 0.102 ±0.007*0.116 ±0.009＊△0.097 ±0.008 0.376 ±0.019*0.549 ±0.032＊△0.093 ±0.007 0.537 ±0.024*0.7411 ±0.444＊△0.0927 ±0.005 0.409 ±0.0140*0.550 ±0.020＊△

表2 大鼠腦組織各時間點VEGF表達(平均光密度)(n=6，)

表2 大鼠腦組織各時間點VEGF表達(平均光密度)(n=6，)

與A組相比*P＜0.05;與B組相比△P＜0.05

組別/時間點6h 12h 24h 48h A組B組C組99.36 ±3.29 107.04 ±4.59*116.69 ±7.14＊△99.37 ±3.29 130.71 ±6.72*132.73 ±10.55＊△105.27 ±5.18 136.20 ±10.00*148.04 ±13.17＊△99.37 ±3.29 145.47 ±7.85*159.24 ±9.91＊△

表3 大鼠腦組織各時間點CD105表達(平均光密度)(n=6，)

表3 大鼠腦組織各時間點CD105表達(平均光密度)(n=6，)

與A組相比*P＜0.05;與B組相比△P＜0.05

組別/時間點6h 12h 24h 48h A組B組C組58.94 ±3.02 87.03 ±6.012*118.24 ±6.85＊△58.94 ±3.02 114.03 ±7.36*143.93 ±7.18＊△66.95 ±2.84 121.60 ±7.23*163.85 ±5.08＊△68.58 ±2.78 137.49 ±6.53*162.25 ±4.4＊△

3 討論

腦缺血后，缺血區血管再生范圍和程度影響了缺血區的血流灌注，增加缺血區血供或者促進血管再生可加快腦缺血后損傷腦組織的修復。近些年研究發現SHH信號通路與血管再生有著密切關系。Kusano等［6］研究發現SHH通路可以誘導局部缺血組織血管再生，且SHH誘導血管新生的能力強于VEGF。Pola R等［7］在研究SHH通路時指出SHH通路可以通過上調VEGF和ANG誘導形成較大直徑的血管。SHH信號通路誘導血管再生可能是通過SHH/GLI/SMO通路實現的，SHH信號通路通過PTCH和SMO兩個轉錄因子對靶細胞進行調控。當SHH信號通路處于靜止期時，PTCH與SMO結合抑制SMO活性。當SHH通路被激活時，SHH蛋白與PTCH結合，PTC/SMO復合物釋放SMO活性，SMO激活下游GLI從而誘導目的基因的表達。SHH不足時，PTCH-1表達降低，SHH通路激活時，PTCH-1表達增加。因此PTCH-1常作為檢測SHH信號通路活化的標志分子［8］。本課題通過PCR測定PTCH-1反映SHH信號是否處于激活狀態。

purmorphamine是一種小分子嘌呤衍生物，分子量為520.62，可透過血腦屏障。purmorphamine與SMO結合后SMO蛋白空間構象發生改變從而激活SHH通路下游分子。本研究發現PTCH-1在腦缺血后6h表達有所增加，提示腦缺血后存在內源性的SHH信號通路激活，這與既往研究結果一致。加入purmorphamine溶液后，PTCH-1表達明顯增加，24h升高最為顯著，48h有所降低，與模型組相比有統計學意義，提示給予外源性SHH信號通路激活劑purmorphamine可以有效激活SHH信號通路，但具有時效性，隨著時間推移，這種效應逐漸減弱，難以持續激活SHH信號通路。

VEGF是血管生長的重要調節物質，在內皮細胞分化和神經形成過程中參與早期血管生成，促進血管內皮細胞存活和增殖，加速形成新生血管。CD105(endoglin)通過對TGF-β調控影響血管再生，也是血管再生中必需的因子。CD105在正常組織幾乎不表達，但是在新生血管強表達，可以作為新生血管內皮細胞特異標志物。有研究表明CD105測定的血管密度是一個獨立的指標，能定量區別新生血管和已存在的血管［9］。本研究結果發現在腦缺血后6h促血管再生因子VEGF和新生血管標志物CD105表達開始增多，于48h升高最為顯著，提示腦缺血可刺激體內的內源性VEGF和CD105表達，應用purmorphamine后，VEGF和CD105的表達均明顯增加，提示激活SHH通路后可上調VEGF和CD105表達，促進血管再生。另外，應用purmorphamine后，PTCH-1的表達高峰在24h，而VEGF和CD105表達高峰有一定延遲，提示SHH信號通路激活促進血管再生的效應不是即刻的，這可能與SHH信號通路下游分子較多有關，也可能與相關蛋白的分泌表達時間有關。

可否連續應用外源性激活劑purmorphamine激活SHH通路而形成對血管再生的持續效應有待于進一步研究。

圖1 免疫組化測定各時間點VEGF表達情況(A:假手術組;B:模型組;C:給藥組)

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