桔梗根的水提取物對腫瘤侵潤和轉移的抑制作用

畢承華

桔梗是中國傳統的草藥，它的免疫刺激效果和抗腫瘤效果是眾人皆知的。Lee用體外和體內腫瘤轉移實驗檢驗了桔梗根水提取物的抗腫瘤轉移活性［1］。CK通過一個再生的基底細胞膜抑制了B16-F10黑色素瘤細胞，并強烈抑制B16-F10黑色素瘤細胞黏附到細胞外基質，例如基質膠，纖維結合蛋白和層粘連蛋白底物。CK也抑制了實驗性肺癌并延長了體內幸存時間。除此之外，CK擴大了NK細胞活性。這些結果表明了CK可能通過抑制腫瘤細胞黏附到基底細胞膜和激活NK細胞而減少B16-F10黑色素瘤細胞肺轉移的程度。

桔梗的根既可食用又可作為傳統的藥物治療成年疾病，例如支氣管炎、哮喘、肺結核、高脂血癥和炎性疾病，也作為鎮靜劑使用。近來，有人工栽培20年的桔梗中提取的成分changkil(CK)在大鼠身上具有抗氧化、保肝和阻止肝纖維化作用的報道。除此之外，通過Toll-like4受體樣作用它也可以激活巨噬細胞。雖然CK通過調控巨噬細胞功能具有擴大免疫反應的作用，但是細胞介導的精確免疫擴增機制卻是不清楚的。此外，CK其他的生物學特性，例如對于腫瘤入侵和轉移的影響尚不清楚。經過以下研究，除調查CK的抗腫瘤活性，關于瘤轉移的治療抑制作用之外，還分析了CK抗瘤轉移效應的機制，探討CK是否通過激活自然殺傷細胞而增強了宿主防御系統抑制腫瘤。這項結果在于證明其在小鼠實驗中有重要的抗轉移活性［2］。

1 實驗研究

采用每分轉數為1640的介質培養基和購置的胎牛血清、從分子探針技術中得到的鈣黃綠素-AM，制備了22年生桔梗根的水提取物進行了實驗研究。方法是，向蒸餾水中加入粉末狀根(5 ml/g)，該混合物在90℃保持10 h，冷卻至室溫，然后濾過和低壓凍干，吸收率約是33.5%(每100 g原干燥根中含有33.5 g剩余殘渣)，將得到的淺黃色水提取物(CK)直接溶解在滅菌生理鹽水中。

采用的動物為Dao Han動物研究公司提供的5～6周大成年雄性小鼠，用嚙齒類動物專用飼料飼養，飲水量不限，飼養環境為(21±2)℃，(50±5)%相對濕度，有12 h晝夜交替的條件。

所采用的細胞株為具有高度侵害和轉移能力的鼠類黑色素瘤B16-F10，和鼠類淋巴瘤YAC-1(自然殺傷敏感靶細胞)，被保存在含 10%FBS，100 μnits/ml青霉素和 100 μg/ml鏈霉素，RPMI1640培養液中，以37℃，含經濕化的5%CO2的環境保存。

應用經改良的在Transwell細胞培養真空箱中進行的腫瘤細胞體外侵潤分析法檢測活性。方法為:將8.0 μm孔徑的聚乙烯吡咯烷酮-游離聚碳酸酯過濾器用500 μg/ml的基質膠包埋后置Transweil真空室內。過濾膜在磷酸鹽緩沖液(pbs)中沖洗后立即干燥。10%FBS-RPMI1640培養液放在室中低位，B16-F10細胞被放在室中高位。將CK溶液加到高位，在37℃含有5%CO2環境中培養4 h。通過0.2%結晶紫染色計數法測量穿過PVPF過濾膜基質膠包埋侵潤的細胞數量。

通過96孔板，使用以往方法的改良法進行細胞黏附測定。小孔預先在室溫下用 50 μl，15 μg/ml纖維結合素，10 μg/ml基質膠，或 50 μl，40 μg/ml層黏連蛋白包埋，然后用0.2 mlRPMI1640/well(包含3%BSA)，培養液在37℃密封1 h。把細胞放在RPMI1640(包含0.1%BAS)培養液中重新懸浮，加入每個孔池中(5×105/ml)，然后加入CK，充分反應。將該混懸液在37℃下培養1 h。小孔池用加熱的磷酸鹽緩沖液(pbs)沖洗兩次以除去未反應的細胞，已反應的細胞在20%甲醇中用0.2%龍膽紫水溶液染色10 min。細胞染色后，立即在200 μl1%十二烷基磺酸鈉中溶解，光密度在560 nm用(microplate reader)全自動定量繪圖酶標儀可以測量。

進行了細胞毒性實驗，用WST-1細胞計數器測定細胞生長的水平。簡言之，把10%FBS-RPMI1640培養液中的B16-F10細胞分放在有96個小孔池中，培養24 h后，把各種不同濃度的CK加到池中，37℃下再培養24 h。鹽酸阿霉素用于抑制對照。把10 μl WST-1溶液加入到每個孔池中，在37℃下培養4 h，然后結束實驗。450 nm處的吸光度可以用(microplate reader)全自動定量繪圖酶標儀測定。

1.1 實驗性肺轉移體內測定 采集B16-F10對數生長細胞，用無血清RPMI1640培養液清洗，混懸，使其在磷酸鹽緩沖液中具有適宜的濃度。將C57BL/6小鼠隨機分成3組，每組有12只，3個組均尾靜脈注射B16-F10細胞混懸液，每次0.2 ml(5×105)。將CK混懸于滅菌生理鹽水中，然后用這種轉移誘導作用以口服方式持續不斷地喂給小鼠。這種治療持續7 d。1組僅被注射B16-F10細胞混懸液所采用的賦形劑，2組與3組分別以20 mg/kg和100 mg/kg劑量注射CK，每天監測動物體重，將每組中的6只小鼠注射腫瘤細胞14 d后處死，將肺臟保存于Bouin's溶液(苦味酸∶20%福爾馬林中性緩沖液∶乙酸=15∶5∶1)中。用立體解剖顯微鏡觀察每組小鼠肺表面的B16-F10菌群數量，測定它們的存活率。需監測存活率兩個月以上。

1.2 脾淋巴細胞的分離 將CK放在滅菌生理鹽水中混懸并以口服方式喂小鼠3 d。該分離方法為以往常用的方法。細胞的成活率總是大于90%。

1.3 自然殺傷細胞活性實驗 NK細胞活性可以通過形成鈣黃綠素-Am釋放分析來測定，這種方法是對曾報道過方法的改良。用10 μg/ml的鈣黃綠素在游離血清-培養液中對YAC-1細胞標記30 min，用純RPMI1640培養液清洗三次后，把0.1 ml標記YAC-1細胞加到96孔板中。將效應器細胞，脾淋巴細胞(0.1 ml)加到每個小孔池中來產生各種效應因子/靶因子比例，小孔板在37℃下培養4個 h，離心后，移除0.1 ml游離細胞上清液，用熒光光度計測量上清液的熒光強度，其在500nm有最大吸光強度，540 nm有最大發光強度。特有的細胞溶解活性按照如下方法計算:百分細胞溶解活性=(E-S)(T-S)×100(E是靶細胞和效應細胞的熒光吸收強度，S僅是靶細胞的熒光發射強度，T是總的熒光強度)。

1.4 統計學分析 結果以均值±標準差表示，組間差異用方差分析表，檢驗是否兩組間存在較大的偏差，Dunnet檢驗用于比較兩組之間的平均值。余下數據用Fisher精密度檢驗和卡普蘭-邁耶生存曲線進行分析。若P＜0.01則在差異上有統計學意義。

1.5 實驗結果如下 CK在腫瘤細胞侵潤方面的作用具有高侵潤和轉移能力的鼠類黑色素瘤細胞群(B16-F10)進行體外侵潤實驗的結果表明，在Transwell細胞培養室中CK對侵潤重建基底膜(基質膠)的B16-F10細胞有抑制作用。CK抑制B16-F10細胞侵潤基質膠/纖維結合蛋白-包埋過濾膜的作用呈現濃度依賴方式，濃度約為20 μg/ml的CK濃度可以抑制50%細胞。

CK在腫瘤細胞與ECM黏附方面的作用可以測定出CK對B16-F10細胞黏附ECM組分的作用，因為腫瘤細胞與ECM的黏附作用是腫瘤侵潤作用中最基本的一步。將B16-F10細胞用濃度1～100 μg/mlCK進行處理，CK可以抑制B16-F10黑色素瘤細胞與基質膠(IC50=43 μg/ml)和纖維結合蛋白(IC50=62 μg/ml)黏附，該作用是呈現濃度依賴方式。CK強烈地抑制B16-F10細胞與層黏連蛋白結合，濃度是31 μg/ml的CK呈現最大抑制細胞黏附作用。在下面一系列的實驗中進一步測定了CK抑制B16-F10細胞與層黏連蛋白底物結合的機制。用濃度為1-100 μg/mlCK在冰上培養B16-F10細胞1 h，然后用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)培養。在另外的實驗中，包埋的層黏連蛋白底物在37℃下培養3 h，用PBS液清洗。表明CK阻礙B16-F10細胞與層黏連蛋白黏附呈現濃度依賴的方式。然而，用CK對底物沒有這樣的抑制作用。

CK對B16-F10黑色素瘤細胞的細胞毒性效應WST分析以檢測CK的抗黏附作用是否由基于細胞毒性的假陽性作用引起。CK在1-100 μg/ml范圍內無影響對B16-F10細胞24 h培養中的生長。另一方面，鹽酸阿霉素作為陽性對照，對體外細胞生長有潛在的抑制作用。CK濃度超過800 μg/ml顯示有輕細胞毒性作用(數據沒有表明)。這些結果說明CK對腫瘤細胞黏附和侵潤作用不是由于CK的細胞毒性作用。

2 CK對肺轉移和存活率的影響

因為上面的結果闡釋CK在體外實驗中對腫瘤侵潤有顯著的抑制作用，這項研究檢測CK在體內實驗對肺轉移的影響，通過給C57BL/6小鼠靜脈注射B16-F10黑色素瘤細胞產生肺轉移酶，結果顯示用CK處理過的小鼠肺轉移酶數量與未處理的比較呈現CK濃度依賴型減少。尤其，用100 mg/kg濃度CK處理小鼠可以抑制65%的肺轉移數量。在這個劑量下，不但對小鼠體重沒有影響，也沒有任何其他毒性臨床癥狀。這些結果闡釋了CK口服有劑量依賴型抗轉移活性。100 mg/kg劑量處理小鼠后存活期高于對照組二倍多。

2.1 CK對體內NK細胞活性的影響 CK對先天宿主反應的作用機制可被檢測，尤其是NK細胞擴增，因為同時給與CK在阻止腫瘤轉移是有效的。NK細胞的擴增表明具有抑制瘤轉移的作用。在此項研究中，CK連續3 d給藥后，用脾淋巴細胞作效應細胞，YAC-1細胞做靶細胞檢測一天NK細胞的活性。結果表示CK以劑量依賴的方式顯著的提高脾NK細胞活性。脾淋巴細胞活性被增加的同時，注射CK 3 d后NK細胞活性達到最高。因此，CK可以激活體內NK細胞的活性。該研究表明CK以劑量依賴的方式較強地抑制肺轉移，肺轉移由注射B16-F10黑色素瘤細胞產生。

3 結論

腫瘤細胞侵潤細胞外基質是瘤轉移過程中重要的一步。細胞外基質蛋白質通過與細胞表面受體結合促進細胞黏附。這個研究表明使用重建基底膜(體外基質膠)，CK可以抑制B16-F10細胞侵潤。一項體外黏附實驗說明CK成功地阻礙了B16-F10黑色素瘤細胞黏附于細胞外基質蛋白質，例如基質膠，纖維結合蛋白和層黏連蛋白，該一致作用呈現濃度依賴的方式。用CK短期預處理B16-F10細胞可阻礙細胞黏附于層黏連蛋白，該事實說明抑制細胞黏附于層黏連蛋白底物與CK和腫瘤細胞表面結合有關而并非與層黏連蛋白底物有關。然而，詳細的機制仍不清楚。一個可能的解釋是CK與層黏連蛋白的受體(例如在腫瘤細胞表面的一種抗抑郁藥)結合，這種結合使CK抑制了腫瘤細胞的黏附與侵潤。24 h的培養過程中，CK在研究所使用的濃度下未顯示任何的細胞毒性反應。這表明CK的抗黏附和抗侵潤作用不是由于細胞毒性產生的。許多報道說明生物活性化合物的抗腫瘤活性通過刺激免疫系統與不同的源物質分離開來。從當歸屬中分離出來的當歸和青牛膽屬考狄葉素增強了B16-F10黑色素瘤細胞植入小鼠的免疫功能，并增加了這些鼠的生存率，同時也抑制了細胞瘤轉移。Song報道了人參的免疫刺激和抗腫瘤作用［3］。這些報道表明來自天然資源的免疫刺激活性物質是研發抗腫瘤藥物很好的候選物質。許多實驗和臨床研究表明先天免疫性在免疫監視和阻斷原發腫瘤轉移中起著重要的作用。體外長期和短期實驗都表明CK既不會對腫瘤細胞產生毒性也不會抑制細胞增殖。這些結果也暗示在減少CK處理過動物瘤轉移過程中，也涉及到了免疫系統。進一步講，腫瘤減少也可能是通過β-細胞或非特異性免疫細胞(例如NK細胞)介導的，因為CK選擇性的激活B細胞和巨噬細胞，但不能激活T細胞。這些結果說明，CK可能調節了先天宿主防御系統機制。除此之外，對抗腫瘤自然免疫系統相關的效應器也被確認為是NK細胞。實際上，許多研究者已經報道了免疫興奮劑激活NK細胞導致腫瘤轉移減少。事實上，腫瘤發病率和轉移在小鼠身上是高發的。除此之外，據報道鄰-半乳糖酰基鞘氨醇可以增加體內NK細胞的數量，也可以抑制腫瘤轉移酶。因此，更有效力的NK擴增劑具有潛在的抗腫瘤活性，但是目前適合的分子靶點還沒有確定。因此，這項研究依據NK細胞的激活作用分析了CK抑制瘤轉移的機制。CK顯著地增強了體內NK的活性。

總之，Lee的實驗證明了CK在體外和體內均顯示出了抗瘤轉移效應［3］。這些結果表明CK的抗轉移活性可能是由于阻斷了NK細胞抗癌時的黏附和擴增。但是CK抗腫瘤活性是否是由于在體內阻斷了一種抗抑郁藥integrin介導的黏著作用需要更進一步的研究。CK對于改善腫瘤侵潤和尋找轉移治療方法可能會提供一個潛在的平臺，它尤其適合于手術后腫塊的清除和癌癥的復發治療。

［1］Lee，E.B.，1973.Phanmacological studies on Platycodon grandiforum A.DC.IV.A comparison of experimental pharmacological efxcts of crude platycodin with clinical indications of piatycodi radix.Yak-ugaku Zasshi93，1188-1194.

［2］Lee，K.，J.，Jeong，H.G.，2002Protective efoct of platycodi radix on carbontetrachloridc-induced hepatotoxicity.Chem Toxicol.40:517-525.

［3］SongJ.Y.，Han，S.K.，Son，E ＞ H.，Pyo，S.N.，Yun，Y.S.，Yi，S.Y.，2002，Induction of sceretory and tumorieidal aetivities in peritoncal macro-phages by ginsan. Int. Immunopharmaeol.2:857-865.