流感病毒的實驗室檢測方法及進展探究

秦金勇

桂林市疾病預防控制中心，廣西桂林 542500

流感病毒又稱為：流行性感冒病毒，具有超強的傳染性、散播性，是一種RNA病毒，歸屬于正黏液病毒科。一般通過呼吸道感染以及人類或動物的呼吸、講話等途徑進行傳播。傳播的效果極快，短時間內就可造成大面積的患有流行性感冒病毒的病例產生。流感病毒主要分為三個等級，即甲型、乙型、丙型。其中甲型流感病毒是一種急性的流感病毒，經過變異發展后對人類自身的傷害巨大，死亡率較高。流感病毒實驗室的建立在于研究流感病毒，分析和總結出流感病毒的分布范圍以及發展趨勢，對我國預防和治療流感性病毒具有至關重要的作用。

對此針對流感病毒實驗室的檢測方法具有十分重要的地位。筆者結合自身的工作經驗，進行如下分析。

1 檢測方法

1.1 流感病毒分離鑒定

流感病毒的分離鑒定方法主要有雞胚接種和細胞培育兩種方法，是流感病毒實驗室最為常用的檢測方法。結合實際的案例，對兩種分離鑒定進行詳盡闡述。

選取在2011—2012年間在該市各哨點監測醫院就診患有流感病毒的病例，采集病例的鼻、咽拭子，放置在事先配置好的Eaglecs的溶液中。將標本進行冷藏，送入流感病毒實驗室。在實驗室中將標本進行常規處理，并添加青霉素與鏈霉素保證標本的完整，易于試驗。在處理后的2 h內，標本放置在低溫冰箱中進行冷藏。冰箱的溫度維持在-70℃左右。

①雞胚接種法。在市場上選取9～11日齡的雞胚和受精雞蛋，進行雞胚接種試驗。在雞胚的兩個雙腔中分別注入2 mL實驗標本，每個標本分別注入三個雞胚之中。完成接種的72 h，觀察孵育情況，并維持溫度在33～35℃之間。夜晚溫度下降至4℃。于第2日，收集孵育雞的羊水以及尿液。將收集的樣本用吸管滴入血凝板中，加入1%的0型紅細胞。對樣本進行均勻搖晃，放入觀察室中，進行觀察。大約在30～60 min后，得出血球凝集效果，進行分析鑒定。根據結果所呈現的陰陽性進行不同處理。如結果呈現為陰性，就將羊水混合采取盲傳一代。如結果呈現為陽性，將采取下一步的鑒定。

②細胞接種法。將選取的樣本分別進行細胞接種，1樣本/2接種。每個樣本接種的容量為0.2 mL。將其放置在細胞中進行培育，溫度維持在33～35℃之間，時間長度為2 h。通過觀察發現細胞每天都會發生相應的病變，且逐漸加深。待病變顯示為3—4加號的程度上，從中收取細胞溶液，將其放入冷藏冰箱，冰凍—融化反復2次。采取紅細胞凝集實驗，根據實驗所呈現紅細胞凝聚滴度，選擇不同的處理方式。以1：8為標準，紅細胞凝聚滴度＞1：8時，將細胞溶液進行稀釋，稀釋程度為1:10的比例。稀釋完成后，進行傳代處理；紅細胞凝聚滴度＜1:8時，直接進行傳代處理。最后進行鑒定，并將結果交至國家流感病毒控制中心。

這兩種流感病毒分離鑒定方便各有利弊。雞胚接種法操作簡單、方便，且對病毒原體的要求度不高，檢出效率較低；細胞培養法操作較難，花費時間較長，但檢出效率較高。同時，兩種分離鑒定方法的靈敏度好、特異性強，常用于流感病毒的分離檢測之中。

1.2 免疫學檢測方法

免疫學檢測方法是依據免疫學的理論，對抗原、抗體、免疫細胞分子、分泌細胞因子進行檢測的實驗手段，廣泛用于流感病毒的檢測。一般針對抗體的檢測，選擇病例的血清樣本；針對抗原的檢測，選擇病例的呼吸道溶液的樣本。

①血清的檢測。血清診斷主要用于抗體的檢測，方法較多，如：血凝抑制方法、中和方法、酶免疫方法、補體結合方法等類型。我國普遍采取的血凝抑制方法進行動態的血清診斷，同時，針對雙份血清可同時進行檢驗。如樣本的特異性抗體表現為4倍以上增高，就可初步診斷為流感病毒。

②抗原的檢測。抗原檢測主要針對甲型流感病毒的檢測，其中包含快速檢測甲型流感病毒方法以及流感病毒斑點酶的吸附方法。快速檢測甲型流感病毒方法強調的是根據病例的鼻、咽拭子的樣本，利用金標記的免疫層分析方法，從中取病體抗原，進行詳細檢測。所需時間較短，僅需要30 min就可以確定流感病毒的類型。這是基于我國2009年大范圍發生甲型流感病毒所從中研究得出的成果。同時，流感病毒斑點酶的吸附方法也廣泛應用于對甲型流感的檢測，主要利用甲型流感的兩種抗體不同，將其分成檢測抗體和捕獲抗體，從中得出檢測結果。

免疫學檢測方法操作簡單、靈敏度較高，特異功能強，具有廣泛的應用性。但免疫學檢測的方法對選取的樣本要求較高，且分析的因素較多。

1.3 核酸檢測方法

核酸檢測主要指的是一種直接檢測流感病毒病原體核酸狀況的方法，這是基于不能檢測抗體和抗原的基礎上，所進行的一種急性檢測。其中包括對核酸本身的提取、擴增以及檢測。這種檢測方法主要強調了對患者自身基因狀況的檢測。通過提取患者的基因，將利用引物以及相關的技術對所提取的基因進行復制和擴大。其中，引物專門指的是可能會發生突變以及可以對其識別的基因。根據基因序列診斷方法、酶切方法等方式對基因中的病毒組織和病毒結構進行判斷，從而發現患者的血液里是否有病毒體的基因，進而判斷流感病毒的類型以及發病程度。其中，檢測方法主要有基因測序方法、逆轉錄PCR、熒光定量PCR等。

核酸檢測方法具有檢測速度快，特異性強、敏感度高的特點，一般基于未能檢測抗體和抗原的情況下。但是核酸檢測方法對實驗室的操作環境、操作設備以及操作人員的要求相對較高，這也決定了核酸檢測所花費的成本較高，一般適合科研機構、衛生疾控系統及較大醫院的流感病毒實驗室的檢測，對于較小醫院還是采用以上的幾種檢測方法。

2 小結

隨著我國醫療水平的不斷提高，針對流感病毒的實驗室檢測技術也隨之提高。其中，由雞胚接種和細胞接種的病毒分離鑒定方法是我國目前最為常用的實驗室檢測手段，其操作簡單，費用較低，靈敏度高，特異性強的特點受到了衛生疾控系統和各大中小醫院流感病毒實驗室的歡迎，是我國主流的檢測技術。但對于急性流感病毒的檢測具有一定程度的弊端，檢測時間較長，影響檢測的效果，從而延誤了病情的診斷和治療。免疫學檢測方法正好彌補了這一缺陷，具有花費時間短、靈敏度高等特點，但其中分為血清和抗原兩種檢測手段，每種檢測的方法的優缺點有所不同。血清檢測時間短、快速便捷、靈敏度低；抗原檢測靈敏度高、花費成本高。另外，核酸檢測是針對缺乏抗體和抗原的情況下，針對基因的檢測，但其高成本、高要求使得中小型醫院望而卻步。

通過以上幾種檢測方法的分析，我們看到了我國在流感病毒實驗室的檢測方法中逐步前進和發展，并取得了一定的成效，促進了我國對流感病毒的檢測和管理，有利于分析流感趨勢，預防流感發生，并真正將流感病毒的快速檢測、型別的鑒定、流行趨勢的分析等技術應用到流感的預防控制及患者治療中，為廣大患者盡快解決病痛，實現社會主義醫療事業的穩固發展。

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