無比山藥丸對去卵巢所致骨質疏松癥大鼠脛骨骨組織形態計量學指標的影響

周晟芳，李 艷，劉梅潔，李亞楠，付小衛，潘靜華，劉 紅，王少君，于 崢，王 瑩，宋長恒，李鴻泓，張治國，鞠大宏△

(1.中國中醫科學院中醫基礎理論研究所，北京 100700;2.浙江中醫藥大學，杭州 310053)

從中醫角度來看，中醫的“脾”和“腎”與骨質疏松癥的發生密切相關，脾腎虛弱是導致該病發生的主要原因之一。無比山藥丸出自《太平惠民和劑局方》，具有健脾補腎的功效，是治療脾腎虛弱的經典方劑?；诖?，本實驗以卵巢切除大鼠為動物模型，采用骨組織形態計量學的方法，探討該方對骨質疏松癥的預防作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選用雌性SD大鼠77只，SPF級，體重190g～220g，由中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心提供(許可證號 SCXK(軍)2007-004)。大鼠在中國中醫科學院中醫基礎理論研究所清潔級實驗動物室內飼養(實驗動物室許可證號SYXK(京)-2010-0032)，適應性喂養10d后開始實驗。

1.1.2 藥物 無比山藥丸方組成:山茱萸9g，澤瀉 12g，熟地 12g，茯苓 9g，巴戟天 6g，牛膝 9g，赤石脂 6g，山藥 15g，杜仲 9g，肉蓯蓉 9g，菟絲子 12g，五味子9g。常規水煎劑，生藥含量分別為1g/ml、2g/ml。鹽酸雷洛昔芬片(商品名:易維特):LILLY，S.A(西班牙)生產，禮來蘇州制藥有限公司分包裝(產品批號 A611193，分包裝批號 L00835，規格:60mg/片)，使用時將其碾碎，用蒸餾水配制成濃度為0.5mg/ml的混懸液。

1.1.3 主要儀器 Reicheit-Jung2040切片機、CTR6000顯微鏡、Qwin V3圖像分析儀系統均為德國Leica公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及處理 先將77只大鼠隨機分為3組，其中空白對照組12只，假手術組12只，造模組53只。造模組大鼠用戊巴比妥鈉麻醉后，摘除雙側卵巢［1］，假手術組只摘取卵巢周圍的少許脂肪組織。術后15d，再將造模組大鼠按體重隨機分為4組，其中模型組13只，雷洛昔芬組13只，無比山藥丸高劑量組14只，無比山藥丸低劑量組13只。然后開始灌胃給藥，無比山藥丸高劑量組20g生藥/kg體重，低劑量組10g生藥/kg體重，給藥濃度分別為2g生藥/ml、1g生藥/ml;雷洛昔芬組5mg/kg體重，給藥濃度分別為 0.5mg/ml。給藥體積均為1ml/100g體重。以上給藥，1次/d，連續6d，休息1d后再連續灌服6d，如此給藥3個月。空白對照組、假手術組、模型組按上法灌服等體積的純凈水。分別在大鼠處死前15d和前3d腹腔注射鹽酸四環素30mg/kg體重，以對骨進行熒光標記。

給藥結束后，將大鼠以45mg/kg體重劑量的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，將各組大鼠迅速斷頭處死，取右側脛骨，用4%多聚甲醛溶液固定，制作不脫鈣骨切片，用于骨組織形態計量學檢測。

1.2.2 指標檢測 取右側脛骨近端1/3，去除其周圍附著的軟組織，采用塑料包埋法，在Reicheit-Jung2040切片機上，用鎢鋼刀切出縱向不脫鈣骨切片;其中1張切片進行甲苯胺藍染色，另1張切片則直接用于熒光觀察。采用Qwin V3圖像分析系統，按照章明放等人的方法進行骨組織形態計量［2］。

(1)骨小梁組織形態計量:骨小梁體積百分比(TBV%):骨小梁體積占被測骨髓腔總體積的百分比，是衡量骨量水平的主要標志;骨小梁吸收表面百分比(TRS%):不規則、凹凸不平的骨小梁表面占骨小梁表面的百分比，它可判斷破骨細胞(OC)的活性;骨小梁形成表面百分比(TFS%):有成骨細胞(OB)被覆的類骨質表面占骨小梁表面的百分比，它可判斷OB的活性;骨小梁礦化率(MAR):骨小梁表面熒光雙標記帶的平均距離除以2次標記相隔的天數;(2)皮質內表面形態計量:類骨質平均寬度(OSW):皮質內表面有OB被覆的類骨質的平均寬度;骨皮質礦化率(mAR):皮質內表面雙標記帶的平均距離除以2次標記相隔的天數。

1.2.3 統計學處理方法 所得實驗數據以均數±標準差(±s)表示，采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗。

2 結果

2.1 無比山藥丸對去卵巢大鼠脛骨TBV%的影響

表1顯示，模型組及各給藥組大鼠脛骨TBV%較假手術組顯著降低。與模型組比較，無比山藥丸高、低劑量組TBV%顯著升高，無比山藥丸高、低劑量組之間比較無顯著性差異。陽性對照(雷洛昔芬)組的TBV%顯著高于模型組。

表1 各組大鼠脛骨TBV%的變化

2.2 無比山藥丸對去卵巢大鼠脛骨TRS%的影響

表2顯示，模型組、無比山藥丸高、低劑量組和雷洛昔芬組與假手術組比較，骨吸收參數TRS%顯著升高;而與模型組比較，無比山藥丸高、低劑量組和雷洛昔芬組的TRS%皆顯著降低。

表2 各組大鼠脛骨TRS%的變化

2.3 無比山藥丸對去卵巢大鼠脛骨TFS%和MAR的影響

表3顯示，與假手術組比較，模型組、無比山藥丸高、低劑量組和雷洛昔芬組大鼠脛骨TFS%和MAR明顯升高，而無比山藥丸高、低劑量組和雷洛昔芬組的TFS%和MAR均低于模型組。

表3 各組大鼠脛骨TFS%的變化

2.4 無比山藥丸對去卵巢大鼠脛骨mAR和OSW的影響

與假手術組比較，模型組大鼠脛骨的 mAR和OSW均明顯增高。無比山藥丸高劑量組mAR與模型組相比明顯降低，OSW無顯著性差異;無比山藥丸低劑量組mAR和OSW與模型組相比皆無顯著性差異。雷洛昔芬組的 mAR和OSW與模型組比較顯著降低，與假手術組相比無顯著差異。

表4 各組大鼠脛骨mAR和OSW的變化

假手術組的上述指標與空白對照組相比，均無顯著性差異，從而排除了手術因素對實驗結果的影響。

3 討論

本實驗采用骨組織形態計量學方法對各組大鼠脛骨不脫鈣骨切片進行了形態計量。結果顯示，摘除大鼠卵巢3個月后，作為衡量骨量多少的重要指標TBV%顯著降低，而衡量骨吸收的指標TRS%以及衡量骨形成的指標TFS%、MAR、mAR和OSW皆顯著增高，說明摘除卵巢所建立的骨質疏松癥模型屬于高轉換型，即摘除卵巢可使骨吸收與骨形成均增加，但由于骨吸收大于骨形成，從而導致骨質疏松癥的發生，這與人類絕經后骨質疏松癥的發生相一致。給大鼠灌服無比山藥丸后，除高劑量的OSW以及低劑量的mAR、OSW外，均可使上述指標發生一定程度的逆轉。這一結果表明，無比山藥丸對去卵巢所致的骨質疏松癥有一定的預防作用。無比山藥丸之所以能產生這樣的作用，從中醫學角度來看，主要是由于其具有健脾補腎的功效。如《太平惠民和劑局方》中載其“治丈夫諸虛百損，五勞七傷……或冷痹骨疼，腰髖不隨，飲食雖多，不生肌肉……此藥能補經脈……厚腸胃，強筋練骨?！?/p>

中醫理論認為，腎藏精主骨生髓，腎精充實，則骨骼堅固有力，正如《醫經精義》所云:“腎藏精，精生髓，髓生骨，故骨者腎之合也。髓者，腎精所生，精足則髓足，髓在骨內，髓足則骨強?！比裟I精虧虛，骨髓化生乏源，骨失其養，則骨脆易折，也就會導致骨質疏松癥的發生。腎為先天之本，脾為后天之本，腎精的充實有賴于脾運化的水谷精微來滋養和補充;若脾失運化，水谷精微等營養物質不能正常生成和輸布，則腎精乏源而致腎精虧虛，進而導致骨質疏松癥的發生。由上觀之，中醫的“脾”、“腎”在維持骨代謝方面發揮著重要作用，脾腎虛弱是導致骨質疏松癥發生的主要原因之一。本研究從實驗角度為這一認識提供了進一步的科學依據。

［1］鞠大宏，張春英，王安民，等.溫補腎陽方對去卵巢所致骨質疏松癥大鼠 IL-1和 IL-6活性的影響［J］.中國中醫基礎醫學雜志，2000，6(4):29-32.

［2］章明放，張乃鑫，譚郁彬.運動對雌性大鼠去勢后骨質疏松癥的作用［J］.中華骨科雜志，1994，14(6):365-369.