不同濃度的嗎啡與5-氟尿嘧啶聯合應用對MCF-7乳腺癌細胞凋亡與細胞周期的影響

王志學 孫立新 李汝泓 雷 燕 于鐵莉 邱利飛 閆彩云

(承德醫學院附屬醫院麻醉科，河北 承德 067000)

由于手術、化療、放療、內分泌治療及免疫治療等綜合治療措施的實施，乳腺癌病人的死亡率開始下降，生存期得以延長。但是乳腺癌患者中疼痛的發生占有很大的比例，因此解除或減緩癌癥病人的疼痛是一項重要的任務，嗎啡(Morphine)作為阿片類藥物的一種，目前仍然是癌痛治療的主要手段。近年來人們發現，嗎啡在鎮痛的同時，會影響細胞的增殖和凋亡，主要通過阻滯細胞周期(抑制細胞周期G1→S期進展)、誘導促凋亡蛋白表達、增強腫瘤細胞對凋亡信號敏感性而發揮抑癌活性〔1～3〕。但由于癌癥病人的疼痛治療往往不是單獨實施，常與癌癥病人的化療同時進行，而嗎啡與化療藥物聯合應用對抗癌效果的影響尚未見報道。5-氟尿嘧啶(5-Fu)是各期乳腺癌的基礎化療藥物，目前仍廣泛應用于臨床一線。因此，本研究以5-Fu為代表，研究嗎啡與5-Fu聯合應用對MCF-7乳腺癌細胞凋亡和細胞周期的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑和儀器 Annexin V-EGFP，南京凱基生物科技發展有限公司;胎牛血清，天津血液學研究所;RPMI1640培養基，GIBCO BRL公司;胰蛋白酶，中國醫學科學院血研所科技公司;碘化丙啶，美國Sigma公司。FACSCalibur流式細胞儀，美國B＆D公司;YT-CJ-1N超凈工作臺，北京亞泰科隆實驗科技開發中心;CO2電熱恒溫培養箱，日本SANYO公司;QL-901振蕩器，中國其林貝爾;LD5-IA低速離心機，北京雷勃爾離心機有限公司;光學顯微鏡、倒置顯微鏡，日本OLYMPUS;熒光倒置顯微鏡，日本尼康。

1.1.2 藥物 嗎啡注射液，東北制藥集團公司;5-Fu注射液，上海旭東海普藥業有限公司。

1.1.3 細胞 MCF-7乳腺癌細胞，購于南京凱基生物科技發展有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 細胞復蘇成功后，調整濃度為1×106/ml接種于培養瓶，靜置于37℃、5%CO2、100%濕度的培養箱內，用RPMI1640完全培養液進行培養，隔日換液。觀察待貼壁70% ～80%時，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2 分組 共分為8組，分別用含不同藥物的RPMI1640完全培養液培養。N組(對照組)為非藥物處理組，LM組為50μmol/L嗎啡處理組，MM組為250μmol/L嗎啡處理組，HM組為1 250μmol/L嗎啡處理組，F組為500μmol/L 5-Fu處理組，LM+F組為50μmol/L嗎啡與500μmol/L 5-Fu聯合處理組，MM+F組為250μmol/L嗎啡與500μmol/L 5-Fu聯合處理組，HM+F組為1 250μmol/L嗎啡與500μmol/L 5-Fu聯合處理組。

1.2.3 FCM檢測Annexin V-EGFP/PI染色的細胞凋亡情況取對數生長期的細胞，調整細胞濃度約5×105/ml，傳至25 ml細胞培養瓶，共32瓶。常規培養24 h后，根據分組情況更換為含不同藥物的培養液5 ml，每組4瓶，分別孵育48 h。吸棄上清，消化、PBS洗滌，收集細胞(約106/ml以上)于離心管;4℃低速離心(1 500 r/min、5 min)后棄上清，重懸于 500μl的Binding Bufferr溶液，加入 5 μl Annexin V-EGFP 及5 μl PI，混勻，室溫避光反應15 min;1 h內流式細胞儀上機檢測。

1.2.4 FCM檢測細胞周期 另取對數生長期的細胞，接種、培養、藥物處理、分組標識、細胞收集同1.2.3;每管加75%酒精4 ml，4℃固定 24 h;4℃低速離心(1 500 r/min、5 min)，徹底去除酒精;PBS洗滌，震蕩，PI染色，室溫避光放置30 min，流式細胞儀上機檢測。

1.3 統計學分析 所有數據資料以x±s表示。采用SPSS11.5統計學軟件進行處理，進行單因素方差分析(ANOVA)與析因設計方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗。

2 結果

2.1 嗎啡、5-Fu及聯合應用對細胞早期凋亡的影響 單獨應用嗎啡處理48 h，早期凋亡率隨著嗎啡濃度的增加依次增加(P＜0.05，P＜0.01)，濃度為250及1 250μmol/L時，早期凋亡率〔(3.660±0.606)%，(5.343±0.625)%〕較未處理組〔(1.595±0.620)%〕明顯增加(P＜0.01)，表明 250及1 250μmol/L濃度的嗎啡能誘導MCF-7細胞凋亡，且嗎啡對MCF-7細胞早期凋亡的劑量依賴關系已經顯現。50μmol/L時，早期凋亡率〔(2.350±0.550)%〕與未處理組比較無顯著性差異(P＞0.05)。不同濃度嗎啡與5-Fu聯合用藥時，早期凋亡率隨著聯合用藥中嗎啡濃度的增加依次增加〔(8.793±0.975)%，(12.545±1.008)%，(17.245±0.806)%，P＜0.01〕。三組嗎啡與5-Fu聯合應用，均具有協同作用(P＜0.05，P ＜0.01)。見圖1。

圖1 培養48 h后流式細胞儀檢測各組細胞早期凋亡率

圖2 培養48 h后流式細胞儀檢測各組細胞周期

2.2 嗎啡、5-Fu及聯合應用對細胞周期的影響 見圖2。單獨應用嗎啡處理時，G0/G1期細胞比例隨著嗎啡濃度的增加依次增加(P＜0.01)，S期細胞比例隨著嗎啡濃度的增加依次降低(P＜0.01)，而G2M期細胞比例無明顯變化(P＞0.05)，表明嗎啡可以劑量依賴地誘導MCF-7細胞主要被阻滯于G0/G1期。單獨應用500μmol/L 5-Fu處理時，G0/G1期細胞比例減少(P＜0.01)，S期細胞比例增加(P＜0.01)，G2M期細胞比例減少(P＜0.05)，表明5-Fu可以使細胞循環周期主要被阻滯于S期。不同濃度的嗎啡與5-Fu聯合用藥時，G0/G1期細胞比例隨著聯合用藥中嗎啡濃度的增加依次增加(P＜0.05，P＜0.01)，較該濃度的嗎啡單獨處理組均減少(P＜0.01);S期細胞比例隨著嗎啡濃度的增加依次降低(P＜0.05，P＜0.01)，較該濃度的嗎啡單獨處理組均增加(P＜0.01);G2M期細胞比例隨著聯合用藥中嗎啡濃度的增加依次降低(P＜0.05，P＜0.01)，較該濃度的嗎啡單獨處理組均減少(P＜0.01);三組嗎啡與5-Fu聯合應用，均具有協同作用(P＜0.01)。表明兩藥聯合應用既抑制了G0/G1期到S期的轉化，又抑制了S期向G2M期的轉化，也與其中嗎啡的濃度有一定的劑量依賴關系。見表1。

表1 不同藥物處理48 h后對MCF-7細胞周期的影響(x ± s，n=4，%)

3 討論

腫瘤的發生發展是一多基因、多步驟、多階段的復雜過程，凋亡在腫瘤的發生發展過程中主要起負調控作用，可以遏制腫瘤細胞迅速生長〔4〕。近年來的共識是，細胞凋亡的抑制比細胞過度增殖在惡性腫瘤發生和發展過程中所起的作用更重要〔4，5〕。因此針對腫瘤細胞凋亡失衡對腫瘤細胞凋亡進行干預性調節，提高細胞凋亡/增殖的比值就不失為一種腫瘤治療策略，大多數抗腫瘤藥物是通過誘導細胞凋亡來發揮它們的抗腫瘤效應〔6〕。

本文采用此種Annexin V＆PI雙染法，可有效地對細胞凋亡進行定量檢測，靈敏度高，并可區分壞死細胞〔7〕。本實驗中選取作用48 h時檢測。單獨應用不同濃度嗎啡處理時，嗎啡濃度為50μmol/L時，尚不能證明細胞凋亡率增加，其他各處理組的細胞早期凋亡率均有明顯增加，并且隨著嗎啡濃度的提高，有明顯的濃度依賴關系;單獨應用500μmol/L 5-Fu，早期凋亡率也顯著增加;各濃度嗎啡與500μmol/L 5-Fu兩藥聯合應用情況下，早期凋亡率亦均顯著增加，并且隨著其中嗎啡濃度的增加呈現明顯濃度依賴關系。經過析因設計方差分析，各濃度嗎啡與500μmol/L 5-Fu聯合應用對早期凋亡率增加均具有協同作用。

臨床上在應用嗎啡癌痛治療時，常常是一個劑量逐步增長的長期用藥過程。在慢性長期用藥或相對高濃度時(＞250μmol/L持續用藥48 h以上;50～250μmol/L或作用更短時間也可能有效，但本研究沒能進一步證明)，嗎啡會抑制腫瘤細胞增殖，促進凋亡。在使用化療藥5-Fu(其他化療藥有待研究)化療過程中，一定濃度以上的嗎啡(＞50μmol/L持續用藥48 h以上，0～50μmol/L或作用更短時間有待研究)會顯著強化5-Fu誘導的增殖抑制和細胞凋亡。雖然臨床上目前尚未證實阿片類藥物對化療病人的轉歸有何影響，但是從協同促進細胞凋亡這一角度，嗎啡應用的益處并不僅限于止痛。但基于離體實驗之局限性，確切臨床效果還有待于進一步證實。

細胞增殖抑制及細胞凋亡與細胞周期受阻密切相關。一個親代細胞依次經歷分裂間期和分裂期后，形成兩個遺傳物質完全相同的子代細胞，完成其增殖過程〔8，9〕。在惡性腫瘤細胞群體中一部分處于活性增殖狀態，另外的細胞則會停滯在靜止期(G0期)〔10〕。周期素(cyclin)和周期素依賴性激酶(Cdks)復合物作為細胞周期的“發動機”，驅動著細胞有條不紊地依次經過G1→S→G2→M期，完成其增殖過程。而細胞周期調控的異常將導致細胞周期紊亂，增殖失控，最終發生癌變，是腫瘤發生的生物學基礎〔11〕。

細胞分裂和DNA合成是細胞周期的兩個主要事件，細胞增殖的促進或抑制，最終必然通過調節細胞周期各階段的DNA含量來實現。流式細胞儀就是通過測定細胞DNA的含量檢測細胞周期的〔12〕。本實驗結果表明，嗎啡可以誘導MCF-7細胞主要被阻滯于G0/G1期，并且這種細胞周期阻滯存在劑量依賴性，即隨著嗎啡劑量的逐漸增加，G0/G1期的細胞比例也隨之逐漸增加，S期細胞逐漸減少，G2M期細胞比例基本不變。這說明嗎啡抑制了MCF-7乳腺癌細胞周期從G1期到S期的轉化，從而導致了G1期阻滯。G1期是細胞質復制的主要階段，也易接受外界因子的影響。G1期末有一個限制點特定時期，在細胞外條件適宜的情況下，細胞一旦通過限制點，即便撤去刺激生長和分裂的外界信號，仍能沿著細胞周期向前運轉，成為一個自主過程直至完成細胞分裂。而在不適于分裂增殖的細胞外條件下，細胞會延長停留在G1期，甚至暫時退出細胞周期，進入G0期。嗎啡處理后能使細胞周期阻滯在G0/G1期，引起細胞DNA合成減少，增殖受到抑制，阻滯在G0/G1期的細胞一旦進入細胞周期，則可引起周期基因不適當的活化，不是導致增殖，反而誘導凋亡〔13〕。

5-Fu的主要作用靶點是DNA，其在體內轉變為氟尿嘧啶脫氧核苷酸(5-FdUTP)后，與胸腺嘧啶核苷酸合成酶(TS)特異性結合，干擾了細胞DNA的合成。DNA損傷嚴重不能被修復系統修復時，細胞便進行下一事件——凋亡，最終導致細胞死亡〔14，15〕。本實驗結果顯示，5-Fu可以促進 MCF-7細胞從 G1期到S期的轉化，使細胞循環周期主要被阻滯于S期。并且，由于細胞周期被抑制，使處于分裂期的細胞(G2/M)比例顯著減少。這也再次證實了5-Fu是細胞周期特異性藥物，主要作用于S期，這一點從細胞凋亡率上反映的更為明顯。

兩藥聯合使用后，既抑制了G1期到S期的轉化，又抑制了S期向G2M期的轉化，這種協同作用與嗎啡造成G0/G1期阻滯和5-Fu致S期阻滯有關，使處于G2M的細胞比例顯著減少。并且這種細胞周期阻滯存在劑量依賴性，即隨著聯合用藥中嗎啡劑量的逐漸增加，G0/G1期的細胞比例也隨之逐漸增加，G2M的細胞比例逐漸減少，S期細胞組間有減少趨勢。這種結果當然是兩藥分別影響細胞周期聯合作用的體現，也正與細胞凋亡率的變化相吻合。

本研究中嗎啡、5-Fu作用于乳腺癌細胞，通過影響細胞周期可調節細胞增殖和誘導凋亡。目前已經發現了許多參與腫瘤細胞周期調控的分子靶點，例如控制細胞從G1期到S期轉化的cyclinD/Cdk4，6 cyclinE/Cdk2，通過S期的過程需要的cyclinA/Cdk2，cyclinB/Cdk1…… 這些分子靶點可以作為腫瘤治療的基礎〔16～18〕。嗎啡、5-Fu調節細胞周期的機制如何，及其相關的酶、蛋白之間的相互作用都有待于進一步研究。

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