破血化瘀、填精補髓法對腦出血大鼠血腫周圍組織神經生長因子表達的影響

任吉祥 任洪亮 林 雪 趙建軍

(長春中醫藥大學，吉林 長春 130021)

挽救出血灶血腫周圍組織內的神經元是腦出血治療的關鍵。神經生長因子(NGF)與神經元的再生和分化密切相關，在中樞神經系統修復中具有促進神經元存活和誘導神經突起生長的作用。本研究觀察破血化瘀，填精補髓法中藥湯劑對實驗性腦出血大鼠神經系統體征及神經功能缺損評分的影響，同時檢測血腫周圍組織NGF蛋白表達變化，探索破血化瘀、填精補髓法對實驗性腦出血大鼠血腫周圍組織損傷修復的機制。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級Wistar大鼠，雌雄各半，體重250～300 g，由吉林大學藥學院提供，大鼠許可證號:SCXK-(吉)2007-0003。破血化瘀，填精補髓法實驗方劑:水蛭8 g、生大黃10 g、生蒲黃15 g、虻蟲5 g、瓜蔞20 g、三七10 g、石菖蒲15 g、龜板膠10 g，采用傳統煎藥方法，去渣后取藥液進行濃縮，使1 ml藥液中含生藥1 g，4℃保存備用。醒腦健神膠囊(批號:921116，吉林省中醫院制劑室)。腦源性神經營養因子(BDNF)及酪氨酸激酶受體(TrkB)免疫組化試劑盒采用中杉金橋通用型二步法檢測試劑盒(Pv6000)。大鼠腦立體定位儀(美國STOELTING公司);手持式牙科鉆(上海齒科器械廠);光學顯微鏡(日本OLYMPUS公司);BMJ-1型生物組織包埋機(天津航空機電有限公司);RM2235型組織切片機(德國LEICA公司)。

1.2 方法

1.2.1 分組 150只Wistar大鼠隨機分成7組:正常對照組6只;假手術組，模型組，受試藥高、中、低劑量組，陽性藥對照組，每組24只，除正常對照組外，其余6組又分為1、3、7、14 d四個時間點，每個時間點6只。

1.2.2 模型制備 參照文獻〔1〕制造實驗性腦出血模型。實驗動物用10%水合氯醛(350 mg/kg體重)腹腔麻醉，于大鼠腹側尾根部1.5 cm處縱行切開，游離尾動脈，微量進樣器抽取非肝素化尾動脈血50μl。調整腦立體定位儀，使大鼠俯臥位固定于立體定位儀，使前、后囟基本在同一水平面上〔2〕。沿正中線切開頭部皮膚暴露顱骨、前囟和冠狀縫。參照大鼠腦立體定位圖譜，以前囟為0點，于0點前0.4 mm、右側旁開3 mm處鉆孔，達硬腦膜表面。微量進樣器垂直刺入顱骨外表面下6.0 mm處，將50μl動脈血注入右側尾狀核。以10μl/min的速度、約5 min全部注入。留針30 min，緩慢出針1 mm;繼續留針10 min，然后緩慢將針完全退出，骨蠟封住鉆孔。局部涂抹青霉素粉并縫合。假手術組操作過程同上，但不向腦內注血。

1.2.3 給藥方法 正常對照組:自由飲食飲水;假手術組:生理鹽水灌胃，1 ml/100 g，1次/d;模型組:同假手術組。受試藥低劑量組:0.5 ml/100 g湯藥灌胃，1次/d;中劑量組:1 ml/100 g湯藥灌胃，1次/d;高劑量組:2 ml/100 g湯藥灌胃，1次/d。陽性藥對照組:醒腦健神膠囊30 mg/100 g體重，溶于2 ml水灌胃，1 次/d。

1.2.4 大鼠神經功能評分 采用 Longa〔3〕評分法。0分:沒有神經功能缺損;1分:左側前爪不能完全伸展;2分:行走時，大鼠向左側轉圈;3分:行走時，大鼠身體向左側(癱瘓側)傾倒;4分:不能自發行走，有意識喪失。

1.2.5 免疫組化法測定NGF蛋白表達 大鼠以水合氯醛麻醉后，切開胸腔，剝離心臟，止血鉗夾閉下腔靜脈和胸主動脈，剪開右心耳，靜脈留置針刺進左心室。用0.9%生理鹽水灌注，待流出清澈生理鹽水后，改用10%多聚甲醛灌注，待大鼠頸部及上肢僵硬后，斷頭取腦，腦組織沿針道前后5 mm切開，取中段部分。組織固定，梯度脫水，石蠟包埋，切片機切片。進行常規蘇木素-伊紅(HE)染色。根據pv6000說明書進行免疫組織化學技術染色。

1.3 統計學方法 應用SPSS17.0統計軟件進行分析，各組數據指標以x±s表示，組間相差顯著性采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 神經系統體征及神經功能缺損評分 與假手術組大鼠比較，模型組大鼠出現明顯的神經系統病理體征，實驗動物出現左側肢體廢用的偏癱癥狀，以前肢為重，行走過程呈順時針方向追尾狀。與模型組大鼠比較，陽性藥對照組和受試藥各組大鼠在給藥1 d和3 d后上述癥狀明顯改善。到第7天基本恢復正常。見表1。

2.2 NGF免疫組織化學染色結果 在光鏡下，假手術組、模型組、陽性藥對照組和受試藥各劑量組在腦出血1 d時神經細胞損傷明顯，均可見淡黃色NGF蛋白陽性細胞表達;腦出血后3 d和7 d，水腫較前明顯吸收、消退，腫脹減輕，結締組織增生，血腫區內NGF蛋白表達較少，可見少量NGF蛋白表達;14 d后，血腫消失，NGF蛋白表達增加，血腫周圍組織見NGF蛋白陽性神經細胞表達，呈現黃色深染。見圖1。

表1 各組大鼠神經功能缺損評分比較(x ± s，n=6)

圖1 各組大鼠第14天NGF蛋白表達情況

圖2 各組大鼠1 d，3 d，7 d，14 d，NGF 細胞數目比較

在腦出血第1、3、7天，與假手術組比較，模型組NGF陽性細胞無明顯變化(P＞0.05)。在腦出血第14天，與假手術組比較，模型組NGF陽性細胞明顯增多(P＜0.01)。在給藥第1、3、7、14天，與模型組比較，陽性藥醒腦健神膠囊對損傷腦區NGF陽性細胞數量并沒有明顯的影響(P＞0.05)。受試藥各劑量組在給藥第1、3、7天對腦損傷時腦區NGF陽性細胞數量并沒有明顯影響(P＞0.05)。在給藥第14天，與假手術組比較，模型組NGF陽性細胞明顯增高(P＜0.01);但與第7天比較，NGF陽性細胞明顯降低。單因素方差分析表明，受試藥劑量依賴性的增加了腦損傷時腦區 NGF陽性細胞數量〔F(3，28)=13.39，P＜0.01〕。進一步分析表明，與模型組比較，受試藥高劑量和中劑量明顯增加了損傷腦區NGF陽性細胞數量(P＜0.01)，而低劑量組并沒有看到相同的效應。見圖2。

3 討論

中樞神經系統(CNS)的神經元損傷后極難再生，成年哺乳動物CNS軸突損傷后，由于不能進行有實質意義的再生往往導致永久性神經功能缺失。NGF具有調節發育中神經元存活和促進成熟神經系統可塑性的作用，生物學活性分為兩種:①使神經細胞存活率增高;②促進神經細胞突起伸長〔4〕。近年研究發現NGF在神經再生過程中也起著重要的促進作用，賈杰等〔5〕發現急性期腹腔注射NGF可減輕大鼠腦缺血性損傷程度，并可能通過增加腦組織突觸素(Syp)的表達來促進腦缺血性損傷后突觸的形成。侯永春等〔6〕發現葛根素可能通過上調 NGF水平，發揮對腦缺血神經元的保護作用。

本研究發現，與模型組大鼠比較，陽性藥和破血化瘀、填精補髓法受試藥各劑量組大鼠在給藥1 d和3 d后可明顯改善神經功能缺損評分。模型組、陽性藥對照組、受試藥低、中、高劑量組，在第1、3、7天，NGF陽性細胞數量隨著時間的改變無明顯變化;在第14天，NGF的陽性細胞數量明顯增加。可見，運用破血化瘀、填精補髓法中藥湯劑治療腦出血大鼠可明顯減輕神經功能缺損的癥狀，其機制可能與促進NGF表達有關。

1 張朋奇，朱賢立，趙甲山，等.一種大鼠腦內出血模型的建立與評價〔J〕.中國臨床神經外科雜志，2005;10(1):33-5.

2 諸葛啟釧，譯.大鼠腦立體定位圖譜〔M〕.第3版.北京:人民衛生出版社，2005:15-21.

3 Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats〔J〕.Stroke，1989;2(1):84-91.

4 Mudge AW，Neurobiology.Motor neurons find their factors〔J〕.Nature，1993;363:213.

5 賈 杰，胡永善，吳 毅，等.神經生長因子對大鼠缺血性腦損傷急性期的療效研究〔J〕.神經損傷與功能重建，2011;6(1):1-5.

6 侯永春，嚴 孜.葛根素對慢性腦缺血大鼠海馬CA1區NGF表達的影響〔J〕.中國實驗方劑學雜志，2012;18(3):184-6.