促紅細胞生成素對血管性癡呆大鼠海馬CA1區膽堿乙酰轉移酶的影響

黃樹其 牛富生 邵福源

(第二軍醫大學附屬長征醫院神經內科，上海 200003)

血管性癡呆(VaD)是老年期癡呆的重要病因。有研究表明癡呆的發生過程中除腦結構發生病理改變外，腦內與學習記憶過程相關的神經遞質及酶類〔如乙酰膽堿(Ach)、膽堿乙酰轉移酶(ChAT)等〕的代謝也發生異?！?〕。ChAT被認為是與學習記憶相關的腦內神經遞質ACh的促進代謝生成酶，在記憶相關腦區的含量高低與學習記憶能力呈正相關〔1〕。

近年國外研究發現，中樞神經系統在缺血缺氧狀態下促紅細胞生成素(EPO)分泌增多，并被證實是腦組織對缺血缺氧的保護性機制;EPO還可以改善VaD大鼠以及腦缺血后認知功能障礙〔2〕，但是具體機制并不清楚，推測ChAT可能在EPO改善VaD大鼠認知功能障礙過程中起到一定作用。因此，本研究觀察VaD大鼠海馬CA1區ChAT蛋白含量以及ChAT mRNA表達水平的變化，以確定ChAT在EPO改善VaD大鼠認知障礙中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 月齡超過16個月的Wistar大鼠，體重(296±35)g，雌雄不限(購自上海市BK實驗動物公司)，用Y型迷宮訓練篩選符合標準〔3〕大鼠86只進行實驗。

1.2 實驗試劑與儀器 重組人EPO(rhEPO，沈陽三生制藥股份有限公司)，一抗(ChAT兔抗大鼠血清)、即用型SABC試劑盒、RT-PCR試劑盒均購自武漢博士德公司，總RNA抽提試劑盒(華舜生物工程公司)，引物由上海捷倍思基因技術有限公司設計合成。MG-3型Y-迷宮(張家港生物醫學儀器廠)，立體定位儀(美國ASI公司)，MP120電子天平(上海第二天平儀器廠)，YL-3型石蠟切片機(上海儀表廠)，CH型光學顯微鏡、BX60顯微照相機(日本Olympus公司)，PCR儀(美國Beckerman公司)，DY-A型電泳儀、Flous-S multiImage圖像分析系統(美國BIO-RAD公司)，紫外透射分析儀(上海長明光學電子儀器廠)。

1.2 方法

1.2.1 VaD模型制作

1.2.1.1 側腦室套管埋植術 參照Paxinos及Wistar鼠腦圖譜〔4〕，借助PF5-48立體定位儀，用微型電動顱鉆鉆孔，將外徑為0.5 mm的不銹鋼導引管插入左側腦室(AP 1.0 mm，L 1.5 mm，H 3.0 mm)，用502黏合劑和牙托粉固定于顱骨上，在引導管內插入外徑為0.3 mm的不銹鋼內管，其尖端比引導管長1 mm，另一端和微量注射器相連。術后連續肌注抗生素1 w以抗感染。

1.2.1.2 VaD模型的建立 參照Olsson等〔5〕方法，以水合氯醛經腹腔麻醉后行頸正中切口，仔細分離肌肉，鈍性分離暴露雙側頸總動脈，其下置7號手術線，注意避免刺激迷走神經，小心結扎雙側頸總動脈，縫合傷口。VaD模型的驗證方法參照文獻〔2〕。

1.2.2 分組 將86只Wistar大鼠隨機分為4組。假手術組(Sham組):健康大鼠18只，經手術分離雙側頸總動脈，埋線后不結扎而將手術線抽出，然后縫合傷口。除假手術組外均按1.2.1.2方法成功造模。VaD組:21只，EPO側腦室注射+VaD組(E1組):26只，側腦室套管埋植術成功1 w后造模，從側腦室注射 rhEPO，劑量為200 IU/kg，3次/w。EPO腹部皮下注射+VaD組(E2組):21只，造模后腹部皮下注射 rhEPO 1 250 IU/kg，3次/w。實驗中保持溫度恒定。

1.2.3 免疫組化檢測ChAT的表達 分別在術后4、8、12 w各隨機取3只大鼠，10%烏拉坦(1 g/kg)麻醉后打開胸腔，將右心房剪開，行左心室插管，經升主動脈快速灌注37℃生理鹽水約500 ml，然后快速灌注4%多聚甲醛溶液(pH7.4)約250 ml，其間大鼠出現全身抽搐時將大鼠首尾拉直，之后減慢灌流速度，在1 h內再灌注約250 ml 4%多聚甲醛灌注液，此時大鼠全身僵硬。灌注完畢后立即取出腦組織置于充滿灌注液的小瓶中，行石蠟包埋。將石蠟包埋的組織塊作連續切片，厚度為4μm，并置于60℃烤箱中烘干后備用。取充分顯示海馬區的切片行免疫組織化學染色。將切片脫蠟至水化;然后經100%二甲苯Ⅰ、Ⅱ溶液浸泡各5 min，蒸餾水沖洗;無水乙醇1 min，95%酒精1 min，85%酒精1 min，75%酒精1 min，蒸餾水沖洗2 min;將樣本置于磷酸鹽緩沖液(PBS)中漂洗3×3 min，每片樣本滴加封閉液(過氧化物酶阻斷液)50μl，并在室溫下孵育10 min，以阻斷內源性過氧化物酶的活性，吸去封閉液，PBS洗3×3 min。加50μl正常非免疫動物血清，室溫下孵育10 min;除去血清，加入抗體稀釋液配制的最佳稀釋度的第一抗體工作液(1∶100兔抗大鼠ChAT抗體)，于濕盒中4℃ 過夜;次日用PBS洗3×3 min，每片加抗體稀釋液配制的生物素標記的第二抗體工作液，于室溫濕盒溫育1 h;用PBS洗3×3 min，每片加鏈霉素抗生物素-過氧化物酶溶液50μl，于室溫下孵育10 min;用PBS洗3×3 min。每片加100μl新鮮配制的二氨基聯苯胺(DAB)溶液，顯微鏡下控制顯色，顯色完成后用0.1 mol/L PBS(pH7.4)終止反應;切片經過梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹脂封固。定量分析計數方法:每張切片在海馬的錐體細胞層，分別選擇6個相鄰視野，在15×10倍光鏡下做免疫反應陽性神經元計數，計數方法采用標準網格，以“/0.9 mm2”為單位，結果取平均值。

1.2.4 RT-PCR檢測ChAT mRNA的表達 分別在4、8、12 w各組隨機取3只大鼠，20%烏拉坦(1g/kg)腹腔注射麻醉后用斷頭法處死，在冰浴中快速分離出雙側海馬CA1區，置于凍存管中液氮保存;然后按照總RNA提取試劑盒說明書進行海馬組織總RNA提取、定量;分別取各組海馬組織總RNA抽提液1.0μg加至eppendorf管，按照逆轉錄試劑盒說明書操作，依次加入 dNTP(10 mmol/L)5 μl，MgCl2(25 mmol/L)10 μl，10 ×buffer 5 μl，RNase Inhibitor(40 U/μl)1 μl，AMV RTase XL(5 U/μl)1 μl，AMV-Optimized Taq(5 U/μl)1 μl，ChAT 上、下游引物各1 μl，β-肌動蛋白(β-actin)上、下游引物各 1 μl，加滅菌去離子水至50μl。以β-actin引物作為內對照，配制內對照反應體系，以雙蒸水代替模板RNA作為陰性對照。混勻后加石蠟油50μl，再將各反應管同時置于同一PCR擴增儀中，PCR條件為:50℃，30 min;滅活逆轉錄酶并初步激活PCR反應:94℃，2 min;94℃變性30 s，60℃退火 30 s，72℃ 延伸 1 min，共 28 個循環，最后反應終止于72℃ 10 min。β-actin上游引物為5'CCTCTATGCCAACACAGTGC 3'，下游引物為5'GTACTCCTGCTTGCTGATCC 3'，產物大小為211 bp。ChAT上游引物為5'CAGAAGAGCAGTATCATGCCCGA3'，下游引物為 5'TCCAGGCATACCAGGCAGATGCAG 3'，產物大小為296 bp。PCR擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，電泳結果用Flous-SmutiImager生物電泳圖像分析系統進行圖像分析，記錄每條譜帶的面積灰度值，以每例組織電泳帶面積灰度值/β-actin電泳帶面積灰度值的比值作為該標本目的基因表達的相對值。

1.3 統計學方法 應用SPSS16.0統計軟件進行分析，測定值以x±s表示，采用方差分析進行假設檢驗，兩組間采用直線相關分析，相關系數采用t檢驗。

2 結果

2.1 ChAT免疫組織化學染色結果 ChAT免疫反應陽性產物為神經元細胞質內棕褐色沉淀物。Sham組海馬錐體細胞層和顆粒細胞層ChAT免疫陽性神經元最密集。術后4 w，VaD組、E1組和E2組大鼠海馬CA1區ChAT免疫反應陽性神經元減少，與Sham組相比均顯著降低(P＜0.01)，VaD組與E1組或E2組之間均存在顯著性差異(P＜0.05);術后8 w和12 w時，VaD組、E1組和E2組大鼠海馬CA1區ChAT免疫反應陽性神經元數量進一步減少，VaD組比同期E1組或E2組的減少更為顯著(P＜0.01)，但E1組與E2組海馬CA1區ChAT免疫反應陽性神經元數目在各相應時間點均無顯著差異(P＞0.05)。術后4 w、8 w和12 w，VaD組、E1組和E2組大鼠海馬 CA1區ChAT免疫反應陽性神經元計數與相應時間的全天總反應時間(TRT值)呈顯著負相關:r=－0.869(P＜0.05)，與大鼠學習記憶能力呈正相關。由此可知，EPO上調VaD大鼠海馬CA1區ChAT蛋白表達。見表1，圖1。

2.2 ChAT mRNA表達結果 Sham組大鼠術后4 w、8 w和12 w海馬CA1區ChAT mRNA相對表達量無明顯差異;與Sham組相比，相應時間點，VaD組、E1組和E2組大鼠海馬CA1區ChAT mRNA的相對表達量均顯著減少(P＜0.05或P＜0.01);但E1組與E2組大鼠ChAT mRNA的相對表達量在各相應時間點均無顯著差異(P＞0.05)。見表2，圖2。

表1 不同時間點海馬CA1區ChAT免疫反應陽性神經元比較(x ± s，n=3)

圖1 不同時間點海馬CA1區ChAT免疫陽性神經元(×400)

表2 不同時間點海馬CA1區ChAT mRNA的表達(x±s)

圖2 不同時間點海馬CA1區ChAT mRNA RT-PCR電泳圖

3 討論

ChAT為膽堿能神經遞質乙酰膽堿合成的限速酶，分子量為60～70萬，活性中心有咪唑基和巰基，與乙酰輔酶A結合使咪唑基乙?；?然后，膽堿與ChAT活性中心的陰離子部位結合，將乙酰基轉移到膽堿上，合成Ach。ChAT在膽堿能神經元胞體內合成，是膽堿能神經元的特殊標志，其活性變化能直接影響神經元內Ach的合成，從而影響正常神經元的功能，可以作為膽堿能神經元功能狀態的明確標志。由于ChAT可合成Ach，而Ach具有促進學習記憶的生物功能，因此認為ChAT在腦內的含量高低與動物學習記憶功能呈正相關。而ChAT含量和活性高低與學習記憶相關的直接證據則來源于發現在AD病人大腦皮質和海馬中，ChAT和AchE的活性明顯下降，與正常同年齡對照組的腦組織相比ChAT大約減少50%～90%。這一發現隨后又為許多實驗室所證實，但因這些數據均來自尸檢而受到質疑。后來在AD患者大腦活檢標本中也觀察到Ach合成能力和ChAT活性均降低，并且通過ChAT單克隆抗體免疫組化發現AD病人受損的內側前腦Meynert核細胞含有ChAT的細胞。因此，目前公認基底前腦ChAT活性下降是AD的一個重要的生化改變。有研究發現，AD病人的認知功能衰退與腦神經ChAT活性及ChAT陽性纖維數量與老年斑增多具有相關性〔6〕，AD病人ChAT活性明顯低于正常對照組，并且與病人死前簡易精神狀態量表(MMSE)得分存在相關性〔7〕。這些研究證明了ChAT含量與癡呆病人的認知功能衰退存在直接的因果關系，因而本實驗選取ChAT作為的研究對象。

1997年美國慢性腎臟病診療(DOQI)指南規定rhEPO的用量:皮下注射為每周80～120 IU/kg，靜脈給藥為每周 120～180 IU/kg;1999年歐洲指南規定為每周50～150 IU/kg。而目前文獻報道 rhEPO劑量從 375 IU/kg，2次/w～700 IU/kg，3次/w不等。多數作者研究表明，rhEPO劑量＜300 IU·kg－1·w－1難以奏效，故目前多數學者建議最適劑量為500～750 IU·kg－1·w－1。根據熊遠珍〔8〕計算的人和實驗動物按體表面積折算的單位重量用藥量換算系數，大鼠腹部皮下注射rhEPO用量應為1 250 IU/次，故本研究選擇側腦室200 IU·kg－1·次－1和腹部皮下1 250 IU·kg－1·次－1，3次/w注射。本次研究發現側腦室和腹部皮下注射兩種給藥方式并無顯著性差異。

本研究發現，VaD大鼠海馬CA1區ChAT蛋白及mRNA表達均下降，且下降程度隨時間延長逐漸加重，與文獻報道相符〔9〕。VaD大鼠海馬CA1區ChAT缺乏導致Ach的合成減少，可能是導致大鼠空間辨別及學習記憶能力下降的重要原因。ChAT表達下降的原因可能與腦血流減少引起合成原料(乙酰CoA和分子氧)的供給不足有關。本實驗中，EPO組(E1組和E2組)大鼠海馬CA1區ChAT蛋白和ChAT mRNA表達較Sham組明顯下降，但在4 w、8 w和12 w時與同期VaD組比較顯著增加，提示EPO能使VaD大鼠海馬CA1區ChAT含量增加，這可能是EPO改善VaD大鼠認知功能障礙的機制之一。EPO改善VaD大鼠認知功能障礙的機制還有可能與海馬CA1區神經細胞、海馬CA1區神經突觸的可塑性及抑制興奮性氨基酸的毒性作用等有關，尚需進一步研究。

1 Kilgard M.Cholinergic modulation of skill learning and plasticity〔J〕.Neuron，2003;38(5):678-80.

2 黃樹其，邵福源.促紅細胞生成素對血管性癡呆大鼠認知功能的影響〔J〕.醫學臨床研究，2006;23(5):653-5.

3 Liu JI，Chen SP，Gao YH，et al.Effects of repeated electroacupuncture on β-endorphin and adrencorticotropic hormone levels in the hypothalamus and pituitary in rats with chronic pain and ovariectomy〔J〕.Chin JIntegr Med，2010;16(4):315-23.

4 包新民，舒斯云.大鼠腦立體定位圖譜〔M〕.北京:人民衛生出版社，1991:32.

5 Olsson Y，Brun A，Engiuund E.Fundamental pathological lesions in vascular dementia〔J〕.Acta Neurol Scand Suppl，1996;168:31-8.

6 Buttini M，Yu GQ，Shockley K，et al.Modulation of Alzheimer's-like synaptic and cholinergic deficits in transgenic mice by human apolipoprotein E depends on isoform，aging，and overexpression of amyloid beta peptides but not on plaque formation〔J〕.JNeurosci，2002;22(24):10539-48.

7 Minger SL，Honer WG，Esiri MM，et al.Synaptic pathology in prefrontal cortex is present only with severe dementia in Alzheimer disease〔J〕.J Neuropathol Exp Neurol，2001;60(10):929-36.

8 熊遠珍.實驗動物與人用藥量的新換算〔J〕.江西醫學院學報，1997;37(4):41.

9 Gottfries CG，Blennow K，Karlsson I，et al.The neurochemistry of vascular dementia〔J〕.Dementia，1994;5(3-4):163-7.