增殖細胞核抗原和caspase－3在單側輸尿管梗阻大鼠模型中的表達及其意義

李 里，宮 亮，吳玉斌

1 材料與方法

1.1 材料 2011年5—12月選取清潔級Wistar大鼠48只，雄性，體質量120～150 g，4～6周齡，均購自中國醫科大學附屬盛京醫院實驗動物中心。

1.2 方法

1.2.1 分組 48只大鼠采用隨機數字表法分為兩組，假手術組 (sham組)和模型組 (UUO組)各24只，每組術后3、7、14 d分為3組，每組8只。

1.2.2 動物模型的制備 以10%的水合氯醛 (0.3 ml/kg)腹腔注射麻醉，于左側恥骨上切口，沿左腎下極尋找到左輸尿管，UUO組在輸尿管上用4號絲線上下結扎兩處，從中剪斷輸尿管，分層縫合后關閉腹腔;Sham組分離輸尿管不結扎，隨即縫合腹腔，完成手術。

1.2.3 標本的采集和處理

1.2.3.1 尿 術后3、7、14 d收集24 h內的新鮮尿樣，以離心半徑8 cm，3 000 r/min，離心15 min，除去沉渣，放置在－80℃的冰箱內，檢測β2微球蛋白水平。

1.2.3.2 血術后3、7、14 d大鼠腹主動脈采血4 ml，離心半徑8 cm，3 000 r/min，離心10 min，后置于－80℃冰箱保存，檢測血肌酐水平。

從圖譜中可以看出，我國武術文化研究的作者合作知識圖譜呈現集中—分散的狀態。每一個節點代表一個發文作者，節點大小代表作者發文數量的多寡，線條數量和粗細代表了作者之間的合作關系及強度。作者的科研能力與發文數量和載文期刊質量成正比，科研團隊合作不僅能夠促進知識、資源共享，更有助于提高科研產出與學術影響力。

1.2.3.3 腎組織 術后3、7、14 d處死大鼠。留取左側腎組織，以無菌0.9%氯化鈉溶液沖洗，濾紙吸干表面水分，一部分置4%多聚甲醛中固定，制成冷凍切片，待做病理形態學檢測和免疫組化。余下分離腎臟皮質和髓質，至－80℃冰箱，待做蛋白印跡 (Western blot)。

1.3 觀察指標及檢測方法

1.3.1 腎功能檢測 全自動生化分析儀 (中國醫科大學附屬盛京醫院檢驗科)檢測尿β2微球蛋白和血肌酐水平。

1.3.2 腎組織形態學檢測 蘇木素－伊紅 (HE)染色，觀察腎小管間質損傷的程度。

1.3.3 免疫組織化學染色 (SABC)法檢測腎皮質PCNA、caspase－3的表達 實驗步驟按照說明書進行。PCNA抗體購自北京生物技術公司。caspase－3(1∶40)為兔抗人多克隆抗體 (美國Zymed公司)，SABC試劑盒 (武漢博士德生物公司)。PBS替代一抗作為陰性對照。結果判斷:PCNA細胞核染成棕褐色為陽性反應。caspase－3陽性染色主要分布于細胞質中，少部分染于細胞核，呈棕黃色或棕褐色。

1.3.4 陽性細胞百分率和平均灰度測定 應用HPIAS－1000計算機病理圖文系統對免疫組化結果進行分析。每張切片隨機選取10個不重疊的高倍視野 (×400)，分別計腎小管、腎間質陽性細胞和陰性細胞數。陽性細胞百分率=陽性細胞數÷(陽性細胞數+陰性細胞數) ×100%［3］。

1.3.5 Western blot法測定腎皮質PCNA、caspase－3的相對表達量 取大鼠腎皮質100 mg，加入裂解液 (上海吉凱公司提供)500 μl研磨，取出置 EP管中，離心半徑 8 cm，12 000 r/min，4℃，離心10 min，取上清液用BCA法檢測樣品蛋白質水平。50 μg蛋白于SDS－聚丙烯酰胺凝膠中電泳，電轉至PVDF膜。5%脫脂牛奶封閉4℃過夜，分別加PCNA、caspase－3(1∶1 000) 以及內參 β－actin，37℃ 2 h;洗膜3次，每次10 min;加HRP標記羊抗兔IgG(1∶20 000，美國Santa Cruz提供)，37℃ 1 h，洗膜;將適量DAB顯色液平鋪在二抗雜交后的膜上，室溫放置觀察，可出現明顯的棕褐色蛋白顯色帶。半定量方法分析腎組織PCNA、caspase－3的表達，將膜上條帶掃描存入電腦，應用凝膠成像系統軟件分析條帶的光密度，結果用β－actin校正。

1.4 統計學方法 采用SPSS 13.0統計軟件進行統計學處理，計量資料以 (±s)表示，兩組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組術后腎功能的改變 術后3、7 d兩組尿β2微球蛋白水平比較，差異均無統計學意義 (P＞0.05);術后14 d兩組尿β2微球蛋白水平比較，差異有統計學意義 (P＜0.05)。術后3、7、14 d兩組血肌酐水平比較，差異均無統計學意義(P＞0.05，見表1)。

表1 兩組術后腎功能的改變比較 (±s)Table 1 Comparison of renal function changes after operation between two groups

表1 兩組術后腎功能的改變比較 (±s)Table 1 Comparison of renal function changes after operation between two groups

組別 例數 尿β2微球蛋白 (μg/L)術后3 d 術后7 d 術后14 d 14 d sham組 8 1.49±0.17 1.46±0.17 1.45±0.17 43±5 44±3 45±6血肌酐 (μmol/L)術后3 d 術后7 d 術后UUO組 8 1.42±0.19 3.65±0.74 6.10±1.09 46±9 48±8 51±3 t 3.451 7.645 5.234 20.111 12.234 27.121 P值值0.065 0.076 0.049 0.071 0.085 0.067

2.2 腎組織形態學檢測 HE染色顯示，sham組大鼠腎臟腎小管排列緊密、整齊;UUO組術后3 d，可見腎小管腫脹，部分腎小管輕度擴張，小管間質區域出現炎性浸潤;術后7 d腎小管壁擴張，腎間質水腫;術后14 d腎小管結構已經完全被破壞，管腔塌陷 (見圖1)。

2.3 SABC法檢測PCNA、caspase－3的表達

2.3.1 PCNA在大鼠腎臟中的表達變化 PCNA陽性染色主要分布于細胞核，染成棕黃色或棕褐色。sham組PCNA陽性細胞核在腎小管上皮細胞及腎間質細胞表達極少。UUO組術后3、7、14 d PCNA在腎間質細胞核表達明顯增加 (見圖2)。兩組術后3、7、14 d，腎小管內PCNA陽性細胞百分率比較，差異無統計學意義 (P＞0.05);腎間質內PCNA陽性細胞百分率比較，差異均有統計學意義 (P＜0.05，見表2)。

2.3.2 caspase－3在大鼠腎臟中的表達變化 caspase－3陽性染色主要分布于細胞質中，為棕黃色。sham組caspase－3在腎小管及腎間質有少量表達，在UUO組表達增加，以腎小管上皮細胞表達增加為主 (見圖3)。兩組術后3、7、14 d，腎小管內caspase－3陽性細胞百分率比較，差異均有統計學意義(P＜0.05);腎間質內caspase－3陽性細胞百分率比較，差異均有統計學意義 (P＜0.05，見表3)。

表2 兩組術后PCNA陽性細胞百分率比較 (±s，%)Table 2 Comparison of percentage of positive cells of PCNA protein expression between two groups

表2 兩組術后PCNA陽性細胞百分率比較 (±s，%)Table 2 Comparison of percentage of positive cells of PCNA protein expression between two groups

組別 例數 腎小管術后3 d 術后7 d 術后14 d 14 d sham組 8 7.47±1.29 6.37±1.89 6.47±1.39 9.15腎間質術后3 d 術后7 d 術后±3.15 8.05± 4.51 6.15±3.10 UUO組 8 20.29±5.67 35.83±9.50 10.21±4.01 31.56±2.89 52.21±13.41 60.89±3.01 t 16.322 30.112 8.775 26.152 50.111 20.978 P值值0.062 0.058 0.065 0.021 0.034 0.011

2.4 Western blot法測定腎皮質PCNA、caspase－3的相對表達量 Western blot法結果顯示，sham組腎皮質中有微量PCNA、caspase－3的表達;UUO組術后PCNA、caspase－3蛋白表達增加，梗阻時間延長表達增加 (見圖4)。

表3 兩組術后caspase－3陽性細胞百分率比較 (±s，%)Table 3 Comparison of percentage of positive cells of caspase－3 protein expression between two groups

表3 兩組術后caspase－3陽性細胞百分率比較 (±s，%)Table 3 Comparison of percentage of positive cells of caspase－3 protein expression between two groups

組別 例數 腎小管術后3 d 術后7 d 術后14 d 14 d sham組 8 5.31±0.87 5.21±0.67 6.31±0.57 9.05腎間質術后3 d 術后7 d 術后±2.24 8.05±2.24 9.15±1.24 UUO組 8 16.92±5.48 54.85±9.14 66.21±4.01 10.56±2.49 20.15±6.19 25.89±3.01 t 19.012 50.241 20.111 11.258 21.456 11.434 P值值0.035 0.045 0.021 0.014 0.023 0.041

圖1 腎組織形態學改變Figure 1 Histomorphology changes of the renal tissues

圖2 SABC法檢測PCNA的表達Figure 2 Expression of PCNA proteins by SABC method

圖3 SABC法檢測caspase－3的表達Figure 3 Expression of caspase－3 proteins by SABC method

圖4 PCNA、caspase－3的相對表達量Figure 4 Relative expression quantities of PCNA and caspase－3 proteins

3 討論

在引發嬰幼兒腎衰竭的病因中，尿路梗阻所引致的梗阻性腎病是極其常見的［3］。而腎纖維化則是所有梗阻性腎病病程最終的共同途徑。UUO是誘導腎纖維化最經典的模型，該模型易于制作，具備良好的重復性和較高的成功率。在本研究中，通過HE染色觀察到尿路梗阻后腎小管擴張、萎縮、管腔塌陷，腎間質增寬等腎纖維化表現，表明UUO模型造模成功。

本實驗采用全自動生化分析儀檢測不同時間點大鼠尿中β2微球蛋白水平，術后14 d UUO組較sham組明顯升高，表明術后14 d UUO組大鼠腎小管已經受到明顯破壞，存在大量的淋巴細胞浸潤。由于β2微球蛋白的合成與分泌主要是通過淋巴細胞來實現，因此，尿中β2微球蛋白的排出增加。

本實驗血肌酐水平測定結果表明，兩組血肌酐水平無明顯差異，其原因可能是:本研究中損傷的大部分是腎小管，而腎小球功能的良好與否是通過血肌酐來反映的;另一方面在常用腎功能檢查的指標中可應用血肌酐指標，但在腎功能損傷早期并不靈敏。

PCNA是DNA多聚酶的輔助蛋白，是DNA復制的必需物質，其水平反映了細胞增殖程度［4］，是細胞增殖的標志物。本實驗結果表明，sham組PCNA陽性細胞核在腎小管上皮細胞及腎間質細胞表達極少。UUO組術后14 d PCNA在腎小管上皮細胞及腎間質細胞核表達明顯增加。兩組術后14 d腎小管內PCNA陽性細胞百分率無明顯差異，腎間質內PCNA陽性細胞百分率差異明顯。PCNA的合成和表達的量與細胞增殖指數及細胞所處周期有關，已用于惡性腫瘤的診斷和判斷預后［5］。因此，PCNA可作為評價細胞增殖的指標［6］。

近年來關于梗阻性腎病的發病機制已經在分子水平上研究，研究結果顯示細胞凋亡參與輸尿管梗阻后的腎病理生理過程，caspase－3家族是細胞凋亡下游的關鍵酶，大多數觸發細胞凋亡的因素通過caspase－3介導的信號傳導途徑引發細胞凋亡［7］。本實驗SABC法結果顯示，caspase－3在sham組腎小管及腎間質有少量表達，在UUO組表達增加，以腎小管上皮細胞表達增加為主。兩組術后14 d腎小管內caspase－3陽性細胞百分率差異明顯。兩組術后14 d腎間質內caspase－3陽性細胞百分率有明顯差異。Western blot法結果顯示，sham腎皮質中有微量caspase－3的表達;UUO組術后caspase－3表達增加，梗阻時間延長表達增加。提示caspase－3活性增強參與梗阻腎的病理生理過程。梗阻腎組織caspase－3表達隨梗阻時間延長而增強，腎小管中表現更為明顯，說明梗阻腎caspase－3表達增強是腎損傷、腎小管萎縮乃至腎衰竭的重要原因之一。這為在梗阻尚未解除時如何減輕或延緩腎功能損害以及梗阻解除后如何促進腎功能恢復提供新的防治方向。

細胞增殖與細胞凋亡之間的平衡是維持腎臟正常結構形成的關鍵，如何調控細胞凋亡，拮抗細胞增殖，阻止腎纖維化的進一步發展有待進一步研究。

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5 Mizuguchi Y，Miyajima A，Kosaka T，et al.Atorvastatin ameliorates renal tissue damage in unilateral ureteral obstruction ［J］.J Urol，2007，172(6 Pt 1):2456－2459.

6 Yang B，Nahas ME，Thomas GL，et al.Caspase－3 and apoptosis in experimental chronic renal scarring［J］.Kidney Int，2009，60(6):1765－1776.

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