缺血后處理對大鼠腦缺血再灌注的神經保護作用

韓冬，孫淼，張碩，張鴻，馮娟

（中國醫科大學附屬盛京醫院神經內科，沈陽 110004）

缺血性腦卒中是臨床常見病和多發病，目前臨床已開展溶栓治療和動脈介入治療使閉塞的腦動脈再通，但血管再通后再灌注會加重組織細胞功能代謝障礙及結構破壞，即再灌注損傷［1］。如何尋找有效的方法減輕再灌注損傷是臨床上治療腦梗死的關鍵。最近研究發現，缺血后處理能夠能減輕缺血再灌注損傷，是一種有效的內源性保護機制，已成為腦保護研究的熱點。腦缺血后處理［2］是指在缺血再灌注后一定時間內，給予1次或多次短暫性缺血再灌注，使腦組織對前面較長時間的缺血產生耐受性。本實驗采用大腦中動脈線拴法復制大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型，研究缺血后處理對大鼠腦缺血再灌注后的腦保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

雄性清潔級Wistar大鼠，體質量250～280 g，由中國醫科大學附屬盛京醫院實驗動物中心提供。動物隨機分為假手術組、缺血再灌注組（I/R組）和缺血后處理組（IP組），每組10只。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型：采用Longa法［3］制作大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型。實驗組大鼠術前12 h禁食，不禁水。術前稱重，按0.3 mL/100 g體質量腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠后，取正中右旁開0.5 cm作縱行切口。在顯微鏡下分離右側頸總動脈、頸外動脈、頸內動脈。結扎頸外動脈，暫時夾閉頸總動脈、頸內動脈阻斷血流，用眼科剪在頸外動脈殘端血管壁上剪一小口，將準備好的栓線（頭端直徑0.28 mm，購自北京沙東生物技術有限公司）插入頸外動脈，繼續進入頸內動脈，當遇到輕微阻力時停止，結扎栓線根部絲線。栓線插入深度為18～20 mm，其頭端恰好位于大腦中動脈起始處，阻斷了該動脈的血流。將多余的栓線剪去，將其尾端置于正中切口皮下，縫合切口。假手術組栓線插入深度為10 mm，使栓線頭端停留于頸內動脈內而不進入大腦中動脈內。缺血120 min再灌注時，將大鼠再次麻醉，剪開切口縫合線，在手術顯微鏡下部分抽出栓線，將栓線抽出5 mm，此時大腦中動脈血流再通。術中用電熱毯及電烤燈保持大鼠肛溫在36～37℃，術后分籠飼養，24 h后取材。

1.2.2 缺血后處理：在缺血120 min再灌注開始前拔出5 mm栓線，使血管再通30 s，然后再將栓線插入5 mm，阻斷血流30 s，如此進行3個循環，進行缺血后處理。之后拔出栓線實現永久再灌注。

1.3 神經功能缺失評分

參照文獻［3］的5分制評分標準：0分，無神經損傷癥狀；1分，對側前爪不能完全伸直；2分，行走時向對側轉圈；3分，站立不穩，向對側傾倒；4分，不能自發行走，意識喪失。術后約1 h動物可蘇醒，觀察神經功能缺失情況。累計1分以上即為成功模型。

1.4 腦梗體死積測定

TTC染色：腦切成2 mm厚，放于2%TTC染液中，37℃溫育15 min。正常腦細胞染成橘紅色，梗死區不著色，用圖像處理軟件Photoshop 5.0計算梗死面積（橘紅色區域為正常腦組織，白色區域為梗死區）、各腦片梗死面積之和乘以厚度（2 mm）為總的梗死容積。梗死體積百分率=（正常側大腦半球體積-梗死側非梗死區腦組織體積）/正常側大腦半球體積×100%。

1.5 電鏡切片的制備和觀察

大鼠腦缺血再灌注24 h后迅速斷頭取腦，取1 mm×1 mm×1 mm大小的新鮮腦組織，放入2.5%戊二醛中浸泡固定，2%四氧化鋨后固定，梯度乙醇脫水，環氧樹脂618包埋、超薄切片經醋酸鈾、枸櫞酸鉛雙重染色后，在80 kV條件下用JEM-1200EX型透射電鏡觀察結果。

1.6 統計學處理

2 結果

2.1 缺血后處理對大鼠神經功能缺失評分的影響

除假手術組外，各組動物清醒后出現不同程度的神經功能缺損，向患側轉圈、傾倒，不能站立、不能行走。I/R組和IP組神經功能缺損評分分別為2.50±0.55和1.33±0.52，IP組神經功能缺損較I/R組減輕，2組比較差異有統計學意義（P<0.05）。

2.2 缺血后處理對大鼠梗死體積的影響

TTC染色結果顯示，I/R組和IP組右側大腦半球可見腦梗死灶，I/R組和IP組梗死體積百分比分別為29.98%±8.08%和17.06%±1.85%，IP組梗死體積百分比明顯小于I/R組（P<0.01）。

2.3 缺血后處理對大鼠神經元及其髓鞘變化的影響

正常神經元（圖1A）核膜光滑，核仁清楚，核內染色質分布均勻，細胞質內有豐富線粒體、核糖體、粗面內質網、高爾基復合體、溶酶體等細胞器；髓鞘結構（圖1D）正常，包繞軸突。I/R組缺血再灌注后神經元結構改變（圖1B），核膜模糊，細胞質內線粒體嵴減少，線粒體外膜破損，線粒體空泡變性，細胞器減少、破壞；髓鞘（圖1E）板層分離（箭頭所示），髓鞘厚度變薄。IP組神經元（圖1C）及髓鞘（圖1F）結構改變介于二者之間。

3 討論

近年來，研究發現缺血后處理對缺血再灌注損傷具有較強的內源性保護作用。2003年Zhao等［4］在犬的心肌缺血再灌注研究中發現，缺血后再灌注開始時，給予連續3次、每次30 s、再灌注30 s缺血的處理，可以減輕再灌注損傷。2006年Zhao等［5］發現缺血后處理同樣具有腦保護作用，能夠縮小腦梗死體積，減少神經元凋亡，促進神經功能恢復。缺血后處理是一種缺氧耐受現象，具有很強的神經保護作用。

神經元是構成神經系統結構和功能的基本單位，其對于缺血缺氧的耐受性差，在腦缺血再灌注發生后出現損傷，發生壞死，導致神經功能缺失。神經髓鞘是包裹在神經細胞軸突外面的管狀外膜，呈層狀包繞軸突，具有絕緣作用并提高神經沖動的傳導速度，具有保護軸突的作用。在缺血再灌注后同樣出現損害，出現髓鞘剝脫等改變。所以，如何保護神經元及其髓鞘、減少再灌注損傷是缺血再灌注后神經保護的重點。

細胞超微結構是反映細胞損傷程度最直觀的指標。本實驗應用透射電鏡技術觀察神經元及包繞其軸突的髓鞘改變，結果顯示缺血再灌注可導致神經元、髓鞘不同程度損傷，IP組的損傷程度較I/R組減輕。缺血后處理減輕大腦皮層區神經元胞體、基底節區神經細胞髓鞘損傷，說明缺血后處理對神經元具有明顯保護作用。以往報道多數關注神經元細胞胞體改變，而對髓鞘關注不多，髓鞘作為神經元細胞的一部分、腦白質的重要成分，在神經信號傳遞中有重要作用，在缺血再灌注過程中同樣受到缺血再灌注損傷，其損害可破壞神經信號傳導，出現神經功能缺失癥狀，從而對中樞神經系統的整體功能造成嚴重影響。本實驗發現，缺血再灌注后基底節區髓鞘層狀脫失，結構破壞，可導致神經信號傳遞障礙，而IP組髓鞘情況明顯好于I/R組，說明缺血后處理可以保護缺血后處理的神經細胞髓鞘。實驗結果還顯示，大鼠缺血再灌注24 h IP組梗死體積及神經功能評分結果好于 I/R 組，宮利、張慧等［6，7］也有類似報道。證實IP能夠減小缺血再灌注后梗死體積，促進神經功能恢復。所以，無論從微觀神經細胞觀察到宏觀大體腦梗死體積測定，還是從解剖學結構到行為學神經功能評分，缺血后處理均能減輕再灌注損傷，表明IP對神經細胞具有保護作用。

而到目前為止，缺血后處理的腦保護機制還不是完全清楚。研究表明缺血后處理的腦保護作用可能與細胞凋亡［8］、炎癥［9］、蛋白激酶途徑［10］、PI3K/Akt途徑［11］、MAPK 途徑［12］、線粒體滲透性轉化孔開放［13］、線粒體ATP敏感性鉀通道開放［14］等有關。

綜上所述，缺血后處理對于神經元及其髓鞘具有保護作用，能夠減輕梗死體積，改善神經功能損傷。因為缺血后處理時機易于掌握、干預過程簡單、可操作性強，對于腦梗死早期溶栓或栓子自溶血管再通后再灌注損害具有一定的保護作用，所以在未來一定具有廣泛的臨床應用前景，為臨床腦保護提出新的研究方向。

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