非諾貝特聯合替米沙坦對高脂飼養大鼠胰島素抵抗的影響

趙衛華，王占勝，尹玉，胡健

（中國醫科大學附屬第一醫院心血管內科，沈陽110001）

代謝綜合征由一簇相互作用的危險因子組成，而胰島素抵抗（insulin resistance，IR）是代謝綜合征的中心環節［1］。研究表明，替米沙坦可改善肥胖高血壓患者及糖尿病患者IR［2］，非諾貝特可以改善糖尿病患者IR［3］。本研究旨在觀察非諾貝特和替米沙坦及其聯合應用對IR大鼠IR和糖脂代謝的影響，為兩種藥物的合理應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

本實驗采用了 Storlien 等［4，5］的方法，以自配高脂飼料喂養普通Wistar大鼠建立IR模型。健康雄性Wistar大鼠60只（購于中國醫科大學實驗動物中心），體質量140～200 g。適應性喂養1周后隨機分為普通飲食組（NC組）12只和高脂飲食組（HF0）48只。NC組給予普通標準大鼠飼料（由中國醫科大學實驗動物中心提供），其熱量組成為：碳水化合物63.4%，脂肪16.2%，蛋白質20.4%。高脂組給予自行配制的高脂飼料，其熱量組成為：碳水化合物20%，脂肪59%，蛋白質21%。大鼠分籠飼養，自由光照，自由攝取食物和水，每周稱1次。6周后再將高脂組大鼠隨機分為4組：非諾貝特組（F），替米沙坦組（T），非諾貝特與替米沙坦聯合組（F+T）和高脂對照組（HF），每組12只，高脂飲食喂養同時分別給予非諾貝特30 mg/（kg·d）、替米沙坦4 mg/（kg·d）、非諾貝特30 mg/（kg·d）聯合替米沙坦4 mg/（kg·d）、蒸餾水灌胃4周。NC組繼續普通飲食并蒸餾水灌胃4周。微粒化非諾貝特200 mg/粒，法國利博福尼公司產品；替米沙坦80 mg/片，勃林格殷格翰公司產品。

1.2 高胰島素正常葡萄糖鉗夾技術評價IR大鼠模型

藥物干預結束時全部大鼠禁食12 h以進行下一步實驗。從每組大鼠中隨機選取4只做葡萄糖鉗夾實驗：10%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠。仰臥位固定大鼠，燈照以保持大鼠體溫，行頸部正中切口分離右頸靜脈和左頸動脈，分別插入2枚Y型靜脈留置針并縫合固定。頸靜脈通路用于輸注胰島素和葡萄糖，頸動脈通路用于取血標本檢測葡萄糖濃度，頸動脈導管則接一裝有肝素生理鹽水的注射器進行抗凝。葡萄糖和胰島素輸注速率由微電腦數字顯示式注射器泵控制。手術完畢后先靜止30 min，再抽取動脈血0.5 mL測定基礎血糖和血清胰島素水平，然后以恒定速度4 mU/（kg·min）輸注胰島素，每5 min采血1次，用自動血糖儀測定葡萄糖濃度，當血糖低于基礎血糖時開始輸注10%葡萄糖溶液。葡萄糖輸注速率從5 mg/（kg·min）開始，根據血糖調整葡萄糖輸注速率，使血糖保持在基礎血糖水平±0.5 mmol/L范圍。當連續3次血糖均在上述范圍時即達到了穩定狀態。記錄后1 h 13次葡萄糖輸注速率，取其平均值即為葡萄糖輸注率（GIR）。

1.3 大鼠血壓測定

每組大鼠再各隨機取出4只進行有創性頸動脈血壓測定：10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠并仰臥位固定，頸正中切口分離出右側頸動脈，插入事先充滿肝素溶液的靜脈留置針，尾端通過三通連接于血壓測定儀。穩定10 min后記錄血壓，持續時間為30 s。

1.4 生化指標測定

自動血糖檢測儀測定各組大鼠的鼠尾血糖值（FPG）。麻醉處死大鼠，取下腔靜脈血液，立即在4℃恒溫下2 500 r/min離心10 min分離血清，分裝于1.0 mL EP管中-40℃保存，用于測量血脂、血清空腹胰島素（FINS）、血清游離脂肪酸（FFA）。采用日立全自動生化儀（7600-110）檢測血清脂質，包括甘油三酯（TG），總膽固醇（TC），高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C），低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）。FINS測定采用胰島素放射免疫分析藥盒（北京原子高科股份有限公司），FFA測定采用游離脂肪酸試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.5 大鼠內臟標本的留取

大鼠處死后立即取出大鼠附睪脂肪、腎周圍脂肪組織，濾紙吸干后稱質量，將標本于液氮中速凍后，置于-80℃冰箱中保存待用。

1.6 統計學分析

2 結果

2.1 各組大鼠體質量和血清學指標變化

HF 組的體質量（BW）、FINS、FPG、FFA、TG、TC、LDL-C 水平顯著高于 NC 組（P<0.01），GIR、HDL-C顯著低于NC組（P<0.01）。與HF組比較，F組的BW、FINS、TG 顯著降低（P<0.01），FFA 降低（P<0.05），GIR、HDL-C顯著升高（P<0.01）；T組的 BW、FINS、FPG、TG 顯著降低（P<0.01），FFA、LDL-C 降低（P<0.05），GIR、HDL-C 顯著升高（P<0.01）；F+T組的 BW 減輕、FINS、FFA、TG 顯著降低（P<0.01），FPG、TC、LDL-C 降低（P<0.05），GIR、HDL-C 顯著升高（P<0.01）。結果見表1。

2.2 各組大鼠血壓和心率變化

表1 5組大鼠體質量和血清學指標比較（±s）T a b.1 C o m p a r i s o n o f B W a n d s e r o l o g i c a l i n d e x e s i n 5 g r o u p s（±s）

表1 5組大鼠體質量和血清學指標比較（±s）T a b.1 C o m p a r i s o n o f B W a n d s e r o l o g i c a l i n d e x e s i n 5 g r o u p s（±s）

C o m p a r e d w i t h g r o u p N C，1）P ＜ 0.0 5，2）P ＜ 0.0 1；c o m p a r e d w i t h g r o u p H F，3）P ＜ 0.0 5，4）P ＜ 0.0 1.

Item n NC HF F T F+T BW（g） 12 421.3±21.67 500±29.982） 432.7±22.644） 435.8±14.624） 431.2±21.654）FINS（mIU/L） 8 8.99±3.88 42.65±20.782） 18.33±10.414） 15.75±11.974） 20.05±14.824）FPG（mmol/L） 8 3.71±0.48 5.17±0.502） 4.94±0.382） 4.21±0.521），4） 4.64±0.282），3）GIR［mg/（kg·min）］422.13±2.029.03±0.852）14.38±1.572），4）18.39±1.802），4）16.80±1.622），4）FFA（μmmol/L） 8 516.17±212.34 1 152.45±415.922） 797.76±243.843） 796.27±372.403） 659.05±300.104）TG（mmol/L） 8 0.77±0.23 1.86±0.062） 1.05±0.194） 1.13±0.221），4） 0.15±0.074）TC（mmol/L） 8 1.01±0.33 1.72±0.532） 1.36±0.28 1.36±0.34 1.28±0.263）LDL-C（mmol/L） 8 0.19±0.08 0.54±0.282） 0.38±0.121） 0.36±0.131），3） 0.37±0.101），3）HDL-C（mmol/L） 8 0.16±0.031 0.06±0.0232） 0.15±0.0244） 0.13±0.0194） 0.16±0.0264）

HF組大鼠的血壓水平明顯高于NC組（P＜0.01）。T組和F+T組血壓與HF組比較明顯降低（P＜0.01）；F組血壓有所降低，但與HF組比較無統計學差異（P＞0.05）。各組之間平均心率無統計學差異。結果見表2。

2.3 各組大鼠附睪脂肪、腎周圍脂肪的質量變化

HF組大鼠的附睪和腎周脂肪質量均明顯高于NC組（P＜0.01）。藥物干預后3組大鼠的附睪和腎周脂肪質量與HF組比較顯著下降（P＜0.01）。結果見表3。

表2 5組大鼠收縮壓、舒張壓和心率的比較（±s）Tab.2 Comparison of SBP，DBP and HR in 5 groups（±s）

表2 5組大鼠收縮壓、舒張壓和心率的比較（±s）Tab.2 Comparison of SBP，DBP and HR in 5 groups（±s）

Compared with group NC，1）P ＜ 0.05，2）P ＜ 0.01；compared with group HF，3）P ＜ 0.05，4）P ＜ 0.01.

Item NC HF F T F+T SBP（mmHg） 77.7±6.99 125.49±21.572） 106.07±8.231） 89.80±13.014） 88.24±16.364）DBP（mmHg） 57.45±2.49 106.60±18.692） 85.62±21.331） 68.19±14.744） 63.12±20.234）HR（beat/min） 328.6±74.43 349.3±29.11 366.1±53.11 339.1±108.72 375.3±44.05

表3 5組大鼠附睪脂肪與腎周圍脂肪質量比較（±s）Tab.3 Comparison of the weight of epididymal fat and perirenal fat in 5 groups（±s）

表3 5組大鼠附睪脂肪與腎周圍脂肪質量比較（±s）Tab.3 Comparison of the weight of epididymal fat and perirenal fat in 5 groups（±s）

Compared with group NC，1）P ＜ 0.05，2）P ＜ 0.01；compared with Group HF，3）P ＜ 0.05，4）P ＜ 0.01.

Item NC HF F T F+T Testicular fat（g）9.18±1.5715.25±1.182）11.62±2.022），4）11.44±0.772），4）10.74±1.331），4）Fat around kidney（g） 9.79±1.08 14.45±3.542） 10.54±3.024） 9.80±2.284） 10.14±2.364）

3 討論

代謝綜合征是糖耐量減低、高血壓、血脂代謝障礙、高胰島素血癥、IR和肥胖等一系列心血管危險因素集中表現的一種臨床綜合征，基本的病理特征是IR。高脂肪攝入是引發肥胖的主要因素，給予實驗大鼠高脂飲食能夠建立起模擬人類代謝綜合征的模型。本研究表明，高脂飲食使Wistar大鼠體質量增加的程度明顯快于普通飲食喂養的大鼠。在喂養的第4周末，2組間體質量即出現了統計學差異［（277.5±14.18）g vs（292.2±13.77）g，P<0.01］，這種差異持續到實驗的全過程。實驗結束時采用高胰島素-正常葡萄糖鉗夾技術對模型進行檢測發現，HF組大鼠GIR明顯降低；通過測定頸動脈血壓發現HF組大鼠血壓明顯增高；血清學指標FPG、FINS、FFA、TG、TC、LDL-C水平明顯增高而HDL-C水平下降，提示高脂飲食喂養大鼠已經具備IR代謝綜合征的特征，成為穩定可靠的IR動物模型。關于成模時間，不同的實驗因選用的動物品系和高脂飼料的不同而有所差異，但一般普通Wistar或SD大鼠在3～6周后即可出現基本的IR特征。本研究顯示，高脂飲食喂養的大鼠第10周時出現了明顯的IR特征，但此時空腹血糖在HF組明顯高于NC組，顯然血糖正常而血清胰島素濃度開始增高出現的時間在10周之前。

過氧化物酶體增殖物激活受體（PPARs）是配體激活的核轉錄因子，在調節糖、脂肪等能量代謝發揮著重要的作用。非諾貝特是PPARα的激動劑，直接通過增加基因轉錄而增加脂蛋白脂肪酶（LPL）活性，降低血液循環中的TG水平，間接通過降低載脂蛋白C-Ⅲ來增加LPL活性，上調載脂蛋白A-I和A-Ⅱ來增加血循環中的HDL-C水平。非諾貝特除了降脂作用外，還能夠改善 IR［6，7］，在不影響熱量攝入的情況下，防止高脂飼料喂養引起的IR動物模型體質量增加［8］。本研究觀察到，非諾貝特處理后高脂飲食大鼠血清 FINS、TG、FFA 水平降低，GIR、HDL-C顯著升高，同時大鼠體質量增長明顯減緩，內臟脂肪減少，胰島素敏感性增加，IR得到改善，與Ferreira等［9］的研究結果相似。

替米沙坦是血管緊張素Ⅱ1型受體（AT1R）阻斷劑（ARBs），是選擇性PPARγ激動劑。基礎研究表明，替米沙坦在大鼠中通過減弱炎性反應來對抗IR［10］。本研究中替米沙坦降低了IR大鼠PFG、FINS、FFA、TG 水平，升高 GIR、HDL-C，改善 IR，支持Vitale等［11］的研究結論。替米沙坦在改善IR的同時還能減輕體質量，減少內臟脂肪，這一點與噻唑烷二酮類（TZDs）不同。TZDs是完全的PPARγ激動劑，在改善IR同時能明顯增加體質量。其原因可能是激活PPARγ后兩者調控的靶基因不同所致。

非諾貝特和替米沙坦聯合應用是將PPARα與PPARγ激動劑共同干預大鼠的IR狀態。Bhalodia等［12］對大鼠的腎臟缺血再灌注損傷的研究中，非諾貝特和替米沙坦聯合應用可協同增強PPAR的激活。本研究觀察到聯合應用可以明顯降低大鼠體質量、FPG、FINS、FFA、TG、TC，顯著提高 GIR、HDL-C。PPARα激動劑可加速膽固醇向HDL-C轉運，PPARγ激動劑可促進巨噬泡沫細胞中膽固醇的溢出，隨即由HDL-C運輸至肝臟處理［13］，從而降低循環中的膽固醇濃度。本研究中單獨應用非諾貝特和替米沙坦時對TC雖然有所降低，但與HF組比較無統計學差異，聯合應用后卻明顯降低了膽固醇水平，顯示出兩種藥物降低膽固醇的疊加作用。單獨應用非諾貝特和替米沙坦均顯著提高GIR，聯合用藥后GIR改善程度較單獨應用替米沙坦增高而較單獨應用非諾貝特降低，但3組間無統計學差異。非諾貝特可降低血壓，替米沙坦亦降低血壓，兩藥聯合應用后血壓明顯降低。總之，本研究表明，聯合應用非諾貝特和替米沙坦能夠明顯減輕機體脂質代謝紊亂，促進游離脂肪酸的吸收和分解，降低血漿甘油三酯及總膽固醇水平，降低血壓，并且不增加體質量，能夠更好地改善IR，為臨床合理聯合用藥提供了理論依據。

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