腹腔沖洗液BNIP3基因甲基化與胃癌患者腹膜微轉移及疾病的相關性研究

王銀玲，王億龍，王齊暉，李花，周立平，李富順

（中國醫科大學附屬第一醫院1.檢驗科；2.腫瘤放射治療科，沈陽 110001）

胃癌是最常見的消化道惡性腫瘤，其死亡率占惡性腫瘤死亡率的第一位［1］，盡管行胃癌根治術后，5年生存率僅為35%，而且術后轉移和復發較為常見，其中腹膜轉移最常見，約占總復發的30%～50%［2］。腹腔沖洗細胞學（peritoneal lavage cytology，PLC）檢查方法是目前最常用的腹腔脫落細胞學檢測方法，但該細胞學檢查靈敏性較低，很難早期發現腹腔內脫落的癌細胞［3，4］。

近年來隨著寡核苷酸芯片技術的發展，應用甲基化特異的聚合酶鏈式反應（methylation-specific polymerase-chain reaction，MSP）方法檢測微量腫瘤相關基因，使腫瘤微轉移的檢測成為可能。BNIP3是BCL-2蛋白家族促凋亡成員，屬于典型的抑癌基因，該基因啟動子區甲基化狀態改變是腫瘤發生發展的關鍵因素之一。本研究應用MSP方法檢測胃癌組織及腹腔沖洗液中游離細胞BNIP3基因啟動子區甲基化，探討其在胃癌腹膜微轉移診斷中的應用價值。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

以我院2008年1月至2010年1月在腫瘤外科手術治療的80例胃癌患者為研究對象，其中男48例，女32例，年齡31～79歲，平均51.4歲。術前胃鏡檢查及病理確診為胃癌，術前均未行放化療。臨床病理指標及PS因素均按日本胃癌病理規約標準［5］，即 P（+）：肉眼腹膜轉移；S（+）：顯微鏡下漿膜受侵。本研究所有患者均自愿加入并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 標本采集：術中仔細止血，若已有腹水，直接吸出100 mL，若無腹水，于Douglas窩、左膈下置入16號導尿管注入生理鹽水100 mL，輕輕攪動后吸出，于0℃下1 200 r/min離心10 min棄上清液，離心后取沉淀，均分成兩份，一部分行伊紅染色（HE），另一部分沉渣標本于-80℃下保存以備DNA提取。

1.2.2 提取基因組DNA：苯酚氯仿方法提取組織及腹腔沖洗液基因組DNA，乙醇沉淀。DNA濃度根據紫外分光光度計（260 nm）吸光度確定，并根據260∶280 nm吸光度比值確認DNA純度。提取DNA-80℃保存備用。

1.2.3 MSP：取 1 μg基因組 DNA，65℃重亞硫酸鹽處理 12 h（CpGennome DNA Modification Kit，Intergen，美國），處理基因組DNA（具體方法按說明書），保存于-80℃備用；使用基因BNIP3甲基化引物和非甲基化引物行PCR擴增，引物序列如下：甲基化引物，5′-TAGGATTCGTTTCGCGTACG-3′（sense），5′-ACCGCGTCGCCCATTAACCGCG-3′（antisense）；非甲 基 化 引 物 ，5′-TAGGATTTGTTTTGTGTATG-3′（sense），5′-ACCACATCACCCATTAACCACA-3′（antisense）。反應體系包括重亞硫酸鹽處理后模板DNA 2 μL，BNIP3相應的甲基化和非甲基化特異性引物各 0.5 μL，去離子水 16.875 μL、10×PCR 緩沖液（含15 mmol/L MgCl2）2.5 μL、dNTP 混合物 2.5 μL、Taq DNA 聚合酶（Ampli Taq Enzyme，Roche，美國）0.125 μL等，總反應體系25 μL。擴增條件為95℃變性10 min；94℃變性 1 min，59℃退火 1 min，72℃延伸1 min，共35個循環。取PCR產物10 μL，3%瓊脂糖凝膠電泳，用GDS8000（UVP，美國）凝膠成像儀拍照分析。

1.3 統計學分析

所有資料采用SPSS 13.0軟件進行分析。計數資料組間比較采用Fisher精確概率法，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 BNIP3基因啟動子區異常甲基化

80例胃癌組織及相應癌旁組織，胃癌組、癌旁組BNIP3基因啟動子區甲基化陽性率分別為83.75%（67/80）、13.75%（11/80），差異有統計學意義（P<0.05，見表 1。

表1 胃癌組織與癌旁組織BNIP3甲基化陽性率Tab.1 Methylated ratio ofBNIP3in cancer tissues and noncancerous tissues

2.2 腹腔沖洗液中BNIP3基因啟動子區甲基化與胃癌病理特征的關系

如表2所示，BNIP3甲基化陽性率在PTNM分期、淋巴結轉移，腫瘤浸潤深度間比較，統計分析顯示差異均有統計學意義（P<0.05）：隨著臨床分期的增加，BNIP3甲基化陽性率明顯升高；有淋巴結轉移的患者的甲基化率為88.9%，較未轉移的患者陽性率明顯升高；PS因素與BNIP3甲基化陽性率的關系顯示，在漿膜受侵S（+）及肉眼可見腹膜轉移P（+）的14例中，BNIP3甲基化陽性率為100%，同時隨著腫瘤浸潤深度的增加，BNIP3甲基化陽性率也明顯增加。

2.3 MSP法檢測腹腔沖洗液腫瘤相關基因BNIP3甲基化陽性率與PLC法檢測腹腔沖洗液脫落癌細胞的陽性率

80例胃癌患者腹腔沖洗液中，同時用MSP法檢測BNIP3甲基化和PLC法檢測脫落癌細胞：PLC陽性23例，MSP檢測BNIP3甲基化陽性58（58/80）例，且PLC檢測陽性者MSP法檢測均為陽性，MSP法檢測陰性者中無PLC陽性，MSP法檢測腹腔沖洗液腫瘤相關基因BNIP3甲基化陽性率顯著高于PLC法，差異有統計學意義（P<0.05），見表3。

表2 腹腔沖洗液BNIP3甲基化狀態與胃癌病理特征的關系Tab.2 Relationship between the methylation status ofBNIP3and pathological characteristics in peritoneal wash samples

表3 MSP法與PLC法檢測腹腔沖洗液的結果Tab.3 Results of MSP and PLC tested in peritoneal wash samples

3 討論

胃癌術后的復發與轉移是胃癌患者死亡的主要原因，尤以腹膜微轉移最常見，多由腔內游離癌細胞和殘余微小轉移灶的存在導致［6］。有研究［7］認為，腹腔內游離癌細胞是腹膜轉移的先決條件，是影響胃癌預后的獨立危險因素之一。因此早期發現腹腔內游離的癌細胞并給予有效的阻斷治療，是改善胃癌患者預后、提高療效的關鍵。

目前臨床上常用的檢測方法是PLC，但其敏感性較低，近年來隨著寡核苷酸芯片技術的發展，應用MSP法檢測微量腫瘤相關基因甲基化，大大提高了檢測的靈敏度。本研究資料顯示80例胃癌患者腹腔沖洗液中，PLC檢測陽性者MSP法檢測均為陽性，MSP法檢測陰性者中無PLC陽性，MSP法檢測腹腔沖洗液腫瘤相關基因BNIP3甲基化陽性率（72.5%）顯著高于PLC法檢測脫落癌細胞陽性率（28.75%）。由此可見應用MSP法檢測腹腔沖洗液BNIP3甲基化可作為胃癌早期微轉移的輔助診斷方法之一。

已有研究報道人體組織細胞中BNIP3基因異常甲基化與該基因沉默及胃腸腫瘤的發生密切相關［8］。但國內尚未見腹腔沖洗液中游離細胞BNIP3基因異常甲基化與疾病進展的研究報道。本研究顯示胃癌組織的BNIP3甲基化陽性率顯著高于癌旁組織，提示BNIP3基因甲基化與胃癌密切相關。分析其機制可能為［9，10］：（1）BNIP3 編碼產物含有凋亡效應結構域和跨膜結構域，屬于促凋亡家族成員，能與BCL-2，BCL-XL，EIB19k等抗凋亡蛋白相互作用，促進細胞凋亡。故BNIP3不表達或弱表達導致凋亡信號通路受阻，從而導致惡性腫瘤的發生、發展。（2）DNA甲基化調控該基因的轉錄水平（可在轉錄起始階段），即通過基因啟動子及其附近區域內CpG島胞嘧啶的甲基化關閉某種組織或細胞不必需的基因，如腫瘤抑制基因，細胞周期調節基因，抑制腫瘤轉移和浸潤基因等，進而導致細胞增殖和分化的相關基因表達異常，造成細胞失去對正常過程的控制而發生惡變形成腫瘤。

本研究首次對胃癌患者腹腔沖洗液游離細胞BNIP3基因甲基化進行檢測，結果提示腹腔沖洗液BNIP3異常高甲基化與疾病進展有關。

綜上所述，應用MSP法檢測腹腔沖洗液游離細胞BNIP3基因甲基化可作為早期預測胃癌腹膜微轉移及評估疾病進展的有效手段。若能將傳統細胞學檢測方法與基因甲基化聯合檢測，可為早期發現胃癌微轉移提供高敏感性、高特異性的輔助診斷，為評估患者的病情及選擇合理的治療方案提供科學依據。

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