血栓調節蛋白在糖尿病大鼠心肌中的表達及意義

張 雷 董志恒(北華大學基礎醫學院細胞生物教研室，吉林 吉林 3203)

糖尿病(DM)的慢性并發癥累及全身各個系統，其中糖尿病性心肌病(DCM)危害最大。研究顯示，長期的高血糖可引起各種組織蛋白非糖氧化，脂質堆積產生的大量中間產物和自由基誘發各級血管內皮損傷〔1〕。糖基化終末產物的形成促使多種細胞因子與生長因子的釋放與表達，增加血管內皮細胞通透性及單核細胞趨化性，加重了管壁炎癥反應和血管增生，引發了微循環障礙和心肌纖維細胞的增殖〔2〕。因此對于血管內皮細胞損傷及內皮細胞釋放的細胞因子的研究將為DCM的發病機制及防治提供可靠的理論依據，其意義重大。血栓調節蛋白(TM)是存在于內皮細胞表面的一類糖蛋白，對血管內凝血的調節起重要作用。在各種引起血管內皮損傷的病理情況下，由損傷的血管內皮細胞釋放TM，因此TM被認為是血管內皮細胞損傷的一個分子標志物〔3〕。國外有研究〔4〕提出血糖水平的波動與血管內皮損傷顯著相關，同時研究表明2型DM患者TM水平顯著升高，TM的水平與病情呈正相關〔5〕。國內學者研究發現〔6〕，TM在DM出現并發癥時顯著升高，隨病情進展，血管內皮損傷的加重，TM大量釋放入血，而凝血功能嚴重障礙加重了DM并發癥。雖然目前TM在DCM時的作用尚不清楚。基于以上所述，本實驗以TM為研究指標，通過觀察TM在DM大鼠心肌組織中的表達，初步探討其在DCM發生、發展過程中的可能作用，為進一步闡明DCM發病機制提供理論依據和防治的新靶標。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選用普通級、健康SD雄性大鼠50只，6周齡，體重(220±20)g，由吉林大學動物實驗中心提供。大鼠精神狀態良好，反應靈敏，皮毛光澤，飲食正常。大鼠在通風及光線良好、環境衛生、溫濕度適宜的飼養環境下適應性喂養1 w后，進入實驗。實驗期間動物飼料為鼠用常規飼料。

1.2 方法

1.2.1 試劑與儀器 鏈脲佐菌素(STZ)為美國Sigma公司產品。樂康全血糖檢測儀及試紙條為德國羅氏診斷公司生產。血糖高靈敏度試劑盒采用長春匯力生物工程技術開發中心生產的試劑盒。Whatman PCR擴增儀為德國產品。引物序列由上海生工生物工程有限公司合成。免疫試劑盒為北京中杉生物技術公司提供。逆轉錄酶試劑盒由Invitrogen公司生產。DNA Marker(DL-2000)由Takara公司提供。

1.2.2 模型的制備與分組 50只健康SD雄性大鼠適應性喂養1 w后隨機分為正常對照組(C組)及糖尿病組(DM組)，其中C組18只，DM組32只。DM組大鼠禁食 12 h后，按55 mg/kg一次性腹腔注射 STZ溶液(臨用前用0.1 mol/L、pH4.2枸櫞酸緩沖液溶解)，C組腹腔注射等量0.1 mol/L枸櫞酸緩沖液。72 h后測定空腹血糖及尿糖定性，空腹血糖≥16.7 mmol/L，尿糖定性≥，動物多飲、多食、多尿者確定為DM模型。造模完成后，除去造模失敗及死亡大鼠共20只造模成功大鼠完成實驗。分別于2、8、12 w末將大鼠分批處死:2 w末(模型組7只、正常組6只);8 w末(模型組7只、正常組6只);12 w末(模型組6只、正常組6只)。每日觀察大鼠進食、飲水、毛色等一般情況，每周固定時間測量體重、血糖、尿糖。

1.2.3 標本采集及制備

1.2.3.1 光鏡標本 分別在2、8、12 w末進行標本收集。在標本收集前兩組大鼠禁食、禁水12 h，處死前稱體重。所有大鼠乙醚麻醉處死，眶后靜脈采血后，開胸取心臟，用生理鹽水清洗吸干稱重后，將留取的光鏡標本立即置入10%中性甲醛液固定48 h，常規制備石蠟切片。連續4 μm切片，進行HE、PAS及免疫組化染色。

1.2.3.2 電鏡標本 將留取的小塊心肌在0.2 mol/L二甲砷酸鈉緩沖液(pH7.4，含2.5%戊二醛)中細切，4%戊二醛前固定，1%鋨酸后固定1 h，包埋、聚合后制備成超薄切片，電子染色，透射電鏡觀察心肌超微結構，攝片。

1.2.4 血糖及血脂測定 采用葡萄糖氧化酶法測定血糖;采用日立7150型自動生化分析儀測定血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)含量。

1.2.5 心臟指數 將兩組大鼠心臟稱重。計算公式如下:心臟指數=心臟重量/體重。

1.2.6 TM mRNA測定 取速凍大鼠心肌組織約100 mg，按Trizol試劑說明書方法提取心肌組織總RNA。取其中1 μg，進行RT-PCR反應。TM引物序列分別為:上游5'-CGGCTTCCAGTGGGTTAC-3';下游 5'-TTCCCGAGTCCAGTGTCT-3'，擴增產物片段長度為401 bp。同時擴增β-actin，其引物序列分別為:上游 5'-ACAACCGTCATCGCCCACAT-3';下游 5'-ACTTCCCTGACCTTGCTAGT-3'，擴增產物片段長度為540 bp。PCR變性、退火和延伸溫度分別為94℃、55℃和72℃，反應時間分別為45、45和60 s，共進行30個循環。循環完畢再72℃ 延伸10 min。PCR產物用2%瓊脂凝膠電泳分析，電泳后在紫外燈下拍攝照片，然后用凝膠成像處理系統對每一標本的PCR產物擴增的特異性片段進行灰度掃描，以β-actin密度作為參考定量標準，數值以兩者之積分吸光度的比值表示，以對照組的比值作為標準1.0。

2 結果

2.1 一般狀態及心臟指數

2.1.1 大鼠一般情況觀察 正常對照組大鼠精神狀況良好，毛色白、有光澤，反應靈敏、動作自如，飲食水正常，實驗期間未有死亡。模型組大鼠逐漸出現精神萎靡，多飲、多食、多尿等典型糖尿病癥狀。前期(2 w)模型組與正常組相比飲水量并無明顯變化，后期(8、12 w)模型組每只大鼠每天飲水量多于120 ml，每天需換墊料一兩次。模型組早期多動，后期反應遲鈍，動作遲緩，弓背曲體，毛豎無光澤，部分出現爛尾、爛趾、白內障等癥狀。整個實驗過程中3只大鼠造模失敗被淘汰，9只模型組大鼠(1 w 3只，4 w 1只，11 w 2只，12 w 3只)死亡。

2.1.2 大鼠心臟指數變化 與相應C組相比，2 w末DM組大鼠心臟指數無統計學差異(P＞0.05);8、12 w末DM組大鼠心臟指數明顯增加(P＜0.01)。與2 w末DM組大鼠比較，8、12 w末DM組大鼠心臟指數差異顯著(P＜0.01)。12 w末與8 w末DM組相比，心臟指數顯著增加(P＜0.01)。上述結果提示，8、12 w末DM組大鼠已經出現心肌纖維化，心肌肥厚，見表1。

表1 各時段各組大鼠心重、體重、心臟指數比較(±s)

表1 各時段各組大鼠心重、體重、心臟指數比較(±s)

與相應C組比較:1)P＜0.01;與2 w末DM組比較:2)P＜0.01;與8 w末DM組比較:3)P＜0.01

組別 n 心重(g) 體重(g)心臟指數C2 6 1.21±0.02 224.22±3.03 2.74 ±0.03 C8 6 1.36±0.03 243.13±2.46 2.73±0.02 C12 6 1.52±0.02 266.31±3.14 2.75±0.03 DM2 7 1.21±0.02 228.06±6.01 2.74±0.03 DM8 7 1.06±0.031)2) 184.80±4.741)2) 3.80±0.451)2)DM12 6 0.79±0.031)2)3)164.00±1.671)2)3)4.22±0.271)2)3)

2.2 大鼠生化指標的變化 與C組比較，DM組血糖、血清TC、TG、LDL均顯著升高，而HDL降低(P＜0.01)，提示DM 組大鼠伴有明顯的糖、脂代謝紊亂，見表2。

2.3 形態學觀察

2.3.1 HE染色顯示 正常對照組大鼠心肌細胞排列整齊，橫紋清晰，細胞核呈橢圓形，大小均一，位于中央，胞漿染色均勻，閏盤未見異常。2 w末模型組未見明顯病理改變。8、12 w末模型組心肌細胞肥大、排列紊亂，胞漿疏松化，細胞核大小不甚規則，細胞外間質增多。8 w末較12 w末病理變化略輕。

2.3.2 電鏡下 正常對照組大鼠心肌細胞排列整齊，細胞連接清晰，肌絲排列規整，明暗帶清晰;細胞核呈卵圓形，核仁清晰可見;線粒體結構清晰，異染色質成簇狀聚集，細胞間質可見少量膠原纖維。2 w末模型組未見明顯病理變化。8、12 w末模型組心肌細胞排列紊亂，肌絲溶解、斷裂、稀疏，線粒體腫脹、變形，嵴排列紊亂，部分線粒體破裂，肌漿網擴張，閏盤扭曲模糊斷裂，間質可見大量膠原纖維分布;8 w末電鏡病變較12 w為輕，見圖1。

2.4 TM蛋白表達 免疫組化顯示，正常對照組心肌細胞內可見少量稀疏的淺棕色顆粒，主要定位于胞質，呈弱陽性表達。模型組陽性表達明顯增多，其中2 w末可見細顆粒狀棕黃顆粒彌散分布于部分心肌細胞胞質內;8、12 w末胞質內可見濃密的深棕色顆粒;統計分析顯示模型組間陽性表達由低到高順序依次是 2、8 和12 w 末，見表3，圖2。

表2 各時段各組大鼠血糖、TC、TG、LDL、HDL比較(±s，mmol/L)

表2 各時段各組大鼠血糖、TC、TG、LDL、HDL比較(±s，mmol/L)

與C組比較:1)P＜0.01;與DM2組比較:2)P＜0.01，3)P＜0.05;與DM8組比較:4)P＜0.01，5)P＜0.05

組別 n 血糖TC TG LDL HDL C2 6 5.19±0.64 4.71±0.55 1.11±0.29 2.31±0.581.36±0.13 C8 6 5.21±0.65 5.02±0.78 1.15±0.23 2.08±0.62 1.39±0.14 C12 6 5.20±0.64 4.53±0.64 1.28±0.24 2.28±0.67 1.45±0.18 DM2 7 18.19±0.951) 6.00±0.241) 1.87±0.041) 3.87±0.381) 0.85±0.041)DM8 7 21.54±0.811)2) 6.57±0.421)3) 2.09±0.151)3) 4.46±0.211)3) 0.70±0.061)3)DM2 6 27.62±1.921)2)4) 8.15±0.221)2)4) 2.50±0.101)2)3) 5.10±0.101)2)5) 0.56±0.091)2)5)

圖1 各組大鼠心肌組織超微結構變化(×10 000)

圖2 各組大鼠心肌組織TM免疫組化染色(×400)

圖3 大鼠心肌組織TM mRNA的PCR的電泳圖

2.5 TM mRNA表達 與正常對照組相比，2、8、12 w末模型組心肌組織TM mRNA表達明顯增高(P＜0.01);隨病程發展，TM mRNA表達由低到高順序依次為2、8、12 w末，見表3，圖3。

表3 各時段各組大鼠心肌組織TM蛋白及mRNA表達(±s)

表3 各時段各組大鼠心肌組織TM蛋白及mRNA表達(±s)

與C組比較:1)P＜0.01;與DM2組比較:2)P＜0.01，3)P＜0.05;與DM8組比較:4)P＜0.01

組別 n TM蛋白TM mRNA C2 6 1.84±0.08 0.26±0.01 C8 6 1.84±0.09 0.25±0.02 C12 6 1.85±0.09 0.24±0.01 DM2 7 4.83±0.051) 0.36±0.021)DM8 7 8.42±0.261)2) 0.38±0.021)3)DM12 6 15.52±0.151)2)4) 0.44±0.011)2)4)

3 討論

DCM主要病理改變為心肌細胞肥大、凋亡，心肌間質纖維化，心肌微循環障礙及心肌間質重構。長期高血糖所誘發的血管內皮損傷促使各種細胞因子的釋放，引發了微循環障礙和心肌細胞的增殖，在DCM的發生發展中起著重要作用。

張芳林等〔7〕研究發現糖尿病SD大鼠成模8 w后心肌細胞凋亡、心臟舒張功能受損，提示糖尿病動物及患者早期即可發生心肌損傷。本研究通過測量STZ誘導的糖尿病大鼠心臟重量，并計算心臟指數發現，糖尿病大鼠8、12 w末心臟指數顯著高于正常對照組。HE染色及電鏡下顯示，8、12 w末模型組均有心肌細胞肥大、排列紊亂，胞漿疏松樣變，肌纖維排列紊亂、斷裂、溶解，線粒體腫脹、變形，嵴排列紊亂，部分線粒體破裂，肌漿網擴張，間質內大量膠原纖維分布等病理變化，上述結果與穆松?！?〕、黃昶荃等〔9〕研究相一致，證實了DCM 的存在。

TM是血管內皮細胞的膜表面發現的一種糖蛋白，廣泛分布在除中樞神經系統和肝竇外人體各組織器官的動、靜脈、毛細血管及淋巴管內皮細胞內，血管內皮細胞受損時，TM脫落釋放入血，參與調節血管緊張度與免疫反應〔10，11〕。大量研究發現〔12～15〕，DM時高血糖能直接抑制血管內皮細胞DNA合成，影響內皮細胞更新。慢性高血糖狀態下，內皮細胞膜功能蛋白的非酶糖基化使細胞膜受損，高糖至局部血流淤滯，組織缺氧，自由基損傷內皮。此外，山梨醇代謝亢進、血管舒縮因子的不平衡及內皮細胞表面黏附因子增加等因素協同作用導致了糖尿病內皮損傷，而損傷的血管內皮細胞釋放大量TM入血〔16〕。進一步研究發現〔17，18〕，DM時細胞膜上TM的植物血凝素被降解，細胞之間的信號途徑被激活，有絲分裂原活化的蛋白激酶被磷酸化，細胞間黏附分子-1表達增加，促進白細胞黏附到內皮細胞表面，使白細胞運動停滯，引起毛細血管阻塞，內皮細胞功能失調，毛細血管無灌注和血管滲漏，導致組織循環淤滯和局部缺氧，最終微血管通透性增加和新生血管生成。本研究結果提示TM水平反映了DCM心肌血管病變程度，且與DCM的心肌病變呈正相關。結合上述研究結果進一步發現推測，TM在DCM心肌組織中的表達很有可能是DM時，高血糖引起的血管內皮細胞損傷使其脫落于細胞膜表面，并因微血管通透性增加、新血管形成等因素進入心肌細胞間質中，從而參與DCM的發生發展。

總之，DM心肌組織中TM表達狀況可部分反映DCM發生及其嚴重程度，進一步深入研究其在體內的代謝和生理功能，可有利于解釋DM心肌病變危險性增加的原因，這對探討DCM的發病機制提供了新的靶向，對指導DCM的防治也有著極其重要的理論和臨床意義。

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