磷酸化ERK1/2在6-OHDA致PC12細胞損傷中的作用

李 靜 張一娜 范 鷹 馬 蘭 姜禮紅 崔 璨 吳 博

(哈爾濱醫科大學附屬第二醫院老年病科，黑龍江 哈爾濱 150086)

由于帕金森病(PD)的復雜性目前尚未發現理想的治療方法，以阻止神經元退行性變，修復已損傷的神經元，臨床上只能針對癥狀進行對癥治療，因此對帕金森病發病機制的研究依然非常重要。MAPK家族重要成員細胞外信號調節激酶(ERK1/2)研究得最早最深入。它在細胞分化、發育、存活及死亡等生理過程中發揮重要的調節作用。但ERK1/2在細胞凋亡性死亡時的變化及其意義卻存在爭議〔1〕。因此本研究擬在6-OHDA致PC12細胞損傷模型上，觀察ERK通路的表達，并引入特異性的抑制劑U0126和PD98059以探討ERK通路在帕金森病發病中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 PC12細胞，胎牛血清、DMEM(美國Invitrogen公司)，6-OHDA、MTT、U0126 和 PD98059(英國 Sigma-Aldrich 公司)，一抗總 ERK1/2(L34F12，鼠單克隆)，p-ERK1/2(Thr202/Tyr204，兔多克隆)(美國CST公司)，Odyssey IRDye 800 nm熒光抗兔二抗、Odyssey IRDye 700 nm熒光抗鼠二抗(美國Li-COR Biosciences公司)，Hoechst 33258染色試劑盒購自碧云天公司。其他均為國產分析純。

1.2 細胞培養 復蘇凍存的PC12細胞，接種于含5%胎牛血清的DMEM培養基中，在5%CO2，37℃的培養箱內進行培養，隔天換液并傳代。用0.05%的胰蛋白酶消化使細胞從瓶壁上分離下來，以1∶3～1∶4傳代，當細胞進入對數生長期即進行實驗。接種于培養瓶、96孔板用于實驗。

1.3 MTT法 將細胞分為 4組，對照組、6-OHDA組、PD98059+6-OHDA組、U0126+6-OHDA組。將PC12細胞的單細胞懸液以2×104個/孔密度接種于96孔培養板中。對照組加入維生素C溶液，6-OHDA組加入6-OHDA，使6-OHDA終濃度分別為 25、50、100、150、200 和 400 μmol/L，U0126+6-OHDA組加入U0126(10 nmol/L)處理1 h后加入6-OHDA終濃度為100 μmol/L，PD98059+6-OHDA 組加入 PD98059處理 1 h加入6-OHDA 終濃度為 100 μmol/L，于 37℃、5%CO2孵箱中培養。給藥后于第24小時檢測。每孔加入10 μl MTT溶液(5 mg/ml)，37℃繼續孵育4 h。終止培養后，小心吸棄孔內培養上清液。每孔加入100 μl DMSO，振蕩10 min，以終止反應并充分溶解甲臜顆粒。選擇570 nm波長，在酶標儀上測定各孔吸光度值(OD)，實驗組與對照組均設5個復孔，采用組間比較的t檢驗法進行統計學分析。整個實驗重復3次。

1.4 免疫印跡法檢測ERK1/2和磷酸化ERK1/2表達 實驗設正常對照組和 6-OHDA(100 μmol/L)處理 2、6、12、24、48 h組，以及U0126+6-OHDA組和PD98059+6-OHDA組。處理后收集細胞，離心 10 min，以PBS洗2次，用100 μl細胞裂解液于冰浴裂解1 h，離心5 min，收集上清。經BCA法進行蛋白定量后以10%SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白質。電泳后將蛋白轉印至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉后，分別加入1∶1 000稀釋的鼠抗人ERK1/2、單克隆抗體，以1∶1 000稀釋的兔抗人p-ERK1/2多克隆抗體，GAPDH作為內參照，4℃培育過夜，PBST洗滌3次，加1∶5 000稀釋的熒光標記二抗，37℃反應1 h，TBST洗滌3次，采用Odyssey雙色紅外線熒光成像系統(LI-COR公司)掃描圖像入計算機，并進行分析。實驗重復3次。

1.5 Hoechst 33258染色 按前述方法培養PC12細胞，并用6-OHDA處理，于培養后24 h進行檢測。將生長良好的PC12細胞用D-Hanks液清洗2次，在細胞培養皿上直接染色，加入Hoeehst33258(終濃度為10 mg/ml)，37℃染色10 min。清洗5次，在熒光顯微鏡下觀察。

1.6 統計學分析 采用SPSS13.0軟件進行統計分析，計量資料以±s表示，采用t檢驗和方差分析。

2 結果

2.1 6-OHDA作用后PC12細胞觀察 6-OHDA作用后PC12細胞的相差顯微鏡圖片顯示，正常對照組的細胞胞膜完整，胞質豐富，細胞連接廣泛，可見細胞突起;隨著6-OHDA劑量的加大，細胞數目和細胞間連接胞質濃縮與胞膜破裂、胞質內容物外溢逐漸增多，6-OHDA的高劑量組活細胞數目少，細胞間連接中斷，細胞腫脹和細胞皺縮并存。見圖1。

圖1 6-OHDA作用后PC12細胞形態觀察(×100)

2.2 MTT法檢測6-OHDA對 PC12細胞的作用 25、50、100、150、200和400 μmol/L 6-OHDA分別與 PC12細胞共同孵育24 h后，細胞存活率分別為:(0.683±0.039)、(0.597±0.054)、(0.482±0.009)、(0.403±0.010)、(0.068±0.008)、(0.019±0.004)，逐漸降低并呈劑量依賴性。同一時間，藥物濃度越大，細胞活性下降越明顯。6-OHDA處理24 h后半數致死量107 μmol/L，以后實驗我們應用6-OHDA的濃度為100 μmol/L。濃度為200 μmol/L和400 μmol/L時，細胞存活率進一步降低與對照組相比差異非常顯著(P＜0.05)。

圖2 6-OHDA作用后PC12細胞ERK1/2的表達

2.3 6-OHDA對PC12細胞ERK1/2和p-ERK1/2表達的影響

6-OHDA作用后PC12細胞ERK1/2磷酸化蛋白電泳結果見圖2。6-OHDA 作用后 PC12細胞 2、6、12、24 h及 48 h后，ERK1/2蛋白磷酸化水平開始明顯變化，分別為:(1.114±0.199)、(1.171±0.128)、(0.887 ±0.091)、(1.097 ±0.164)、(0.776±0.052)，2 h ERK1/2磷酸化開始明顯升高(P＜0.01)，且一直持續到48 h仍然有較高水平磷酸化，對照組為(0.332±0.046)。

2.4 U0126，PD98059減輕ERK1/2磷酸化和PC12細胞損傷

提前1 h加入U0126和PD98059可以分別減輕6-OHDA(100 μmol/L)對PC12細胞的毒性作用，PC12細胞生存率分別為:(0.589±0.063)和(0.622±0.047)，較單用6-OHDA引起的細胞生存率明顯增加〔(0.486±0.045)，P＜0.05〕，而U0126和PD98059兩者之間無統計學意義。U0126和PD98059對PC12細胞有保護作用(F=142.565，P=0.000)。見圖3。

圖3 U0126，PD98059對6-OHDA作用PC12細胞ERK1/2磷酸化變化

3 討論

6-OHDA是多巴胺能神經遞質的羥基化衍生物，其結構與多巴胺類似，通過自氧化產生泛醌和一系列氧自由基，如過氧化氫(H2O2)，啟動細胞氧化應激，引起多巴胺能神經元的凋亡，常用于制造體內外模型研究PD神經變性的潛在機制。PC12細胞來源于大鼠嗜鉻細胞瘤的無性系，當生長在血清充足的培養基時擁有正常嗜鉻細胞的許多特征，如能合成多巴胺和去甲腎上腺素。PC12細胞擁有多一種多巴胺轉運體，可以向細胞內轉運6-OHDA和多巴胺。6-OHDA通過調整細胞信號傳導通路引起氧化應激而致病。因而我們選取PC12細胞和6-OHDA為研究對象，通過探討6-OHDA的細胞毒性可能的信號轉導位點并進行干預研究。

ERK1/2是細胞信號傳導通路中的重要成員，其活化在細胞增殖和分化等關鍵過程中發揮了重要的作用，一直以來被認為是起保護作用的激酶，很多神經保護/營養因子，如腦源神經營養因子及膠質細胞系神經營養因子，主要通過ERK傳遞信號，后者經歷雙磷酸化而活化，經核轉位發揮保護多巴胺能神經的作用〔2〕，產生諸如分化、神經保護等有益反應。但是近年來有研究表明，6-OHDA可以誘導線粒體ERK1/2激活〔3〕同時還發現在SH-SY5Y細胞系中6-OHDA可誘導線粒體內ERK2活化后導致細胞自噬死亡〔4〕。因此認為它與細胞損傷密切相關，我們發現6-OHDA還誘導ERK1/2在PC12細胞胞漿中持續激活，可直接導致對多巴胺能神經元的毒性這與國外一些研究和我們以往的研究結果相符合〔5，6〕，但6-OHDA如何誘發持續性ERK1/2磷酸化尚待進一步探討。

本文結果提示ERK1/2活化可能參與6-OHDA介導的PC12細胞損傷過程。當然PD的病理過程復雜，是多因素共同作用的結果，除ERK1/2因素外，是否還有其他因素和途徑共同影響神經元變性損傷尚未完全清楚。ERK1/2通路具體傳導因素也還有待進一步研究。

1 Cagnol S，Chambard J.ERK and cell death:mechanisms of ERK-induced cell death-apoptosis，autophagy and senescence〔J〕.FEBS，2010;277(1):2-21.

2 Choi-Lundberg D，Lin Q，Chang Y，et al.Dopaminergic neurons protected from degeneration by GDNF gene therapy〔J〕.Science，1997;275(5301):838 41.

3 Kulich SM，Horbinski C，Patel M，et al.6-Hydroxydopamine induces mitochondrial ERK activation〔J〕.Free Radic Biol Med，2007;43(3):372-83.

4 Dagda RK，Zhu J，Kulich SM，et al.Mitochondrially localized ERK2 regulates mitophagy and autophagic cell stress:implications for Parkinson's disease〔J〕.Autophagy，2008;4(6):770-82.

5 Jun Chen，Milan Rusnak，Paul J，et al.Dopamine promotes striatal neuronal apoptotic death via ERK signaling cascades〔J〕.Eur J Neurosci，2009;29(2):287-306.

6 范 鷹，張一娜，張艷橋，等.蛋白激酶C亞型磷酸化參與6羥基多巴胺對SH-SY5Y細胞的毒性作用〔J〕.中華醫學雜志，2006;86(45):3173-76.