地塞米松、FK－506和CX－659s對TARC產生的調控作用研究＊

于 彬 ，方素萍 ，劉 翔 ，宋 坪 ，董茂盛

(1.中國中醫科學院廣安門醫院國際醫療部，北京 100053;2.中國人民解放軍第二炮兵總醫院肝膽胃腸研究所，北京 100088)

趨化因子是一組由70～90個氨基酸組成的小分子量蛋白質，在免疫及炎性反應過程中對白細胞的正向趨化和浸潤起到重要作用[1]。胸腺活化調節趨化因子(TARC/CCL17)基因位于人第16條染色體，歸屬于β趨化因子，簡稱為CC趨化因子，其N末端有2個連續排列的絲氨酸。TARC可與CD4+CD45RO+記憶T細胞的一部分——Th2細胞表達的CCR4受體結合，誘導Th2細胞向炎癥部位趨化。樹突狀細胞[2]、角質形成細胞[3]，成纖維細胞[4]等均可產生TARC。眾所周知，異位性皮炎等過敏性皮膚疾病的病變部位存在Th2細胞的大量浸潤，產生TARC等趨化因子，誘導CCR4介導的Th2細胞向炎癥部位浸潤[5]。臨床常應用地塞米松、他克莫司(FK－506)[6]和CX－659s[7]治療異位性皮炎等過敏性皮膚疾病，抑制皮膚局部炎性反應，抑制外周單核細胞TARC的表達。但是它們對皮膚的兩種主要結構性細胞——皮膚角質形成細胞和成纖維細胞的作用機制尚不明了。本試驗通過體外試驗研究這幾種臨床常用藥物對皮膚角質形成細胞和成纖維細胞產生TARC的調控作用，報道如下。

1 材料與方法

1.1 試藥

TARC ELISA kit(R＆D公司);白細胞介素4(IL－4)、干擾素γ(IFN－γ)均為Sigma公司產品，批號為200－04;腫瘤壞死因子α(TNF－α)為 PeproTech公司產品，批號為 300－01A);TARC(R＆D公司，批號為277131);地塞米松(Sigma公司，批號為D1756);FK－506和CX－659s(日本藤澤藥品工業株式會社、日本興和株式會社，批號為D73003)。地塞米松、FK－506和CX－659s分別用丙酮、二甲基亞砜稀釋。

1.2 細胞培養

人角質形成細胞株 HaCaT 細胞，由 Dr.N.E.Fusenig，DKFZ，Heidelberg轉讓;人成纖維細胞NG1RGB細胞從日本理化研究所購入，由協和發酵工業株式會社購買。HaCaT細胞及EL4細胞、NG1RGB細胞分別在含10%滅活牛胎兒血清、青霉素(100 U/mL)、紅霉素(100 g/mL)的 DMEM、RITC80－7和 RPMI1640培養液中，5%CO2，37℃狀態下培養。HaCaT細胞和NG1RGB細胞分別以4×105，2×106個/mL濃度播種在24、6孔培養皿中，培養24 h，更換全部培養液。HaCaT細胞中加入地塞米松(10－9～10－5mol/L)、FK－506(10－12～10－5mol/L)或 CX－659s(10－6～10－2mol/L)，加入 IFN－γ(100 ng/mL)刺激，培養 48 h，取上清，15 000 r/min離心3 min，－80℃凍結保存，直至ELISA法檢測TARC蛋白質濃度。NG1RGB 細胞中加入地塞米松(10－9～10－5mol/L)、FK －506(10－9～10－5mol/L)或 CX －659s(10－6～10－2mol/L)，加入IL－4(10 ng/mL)、TNF－α(50 ng/mL)和/或 IFN－γ(100 ng/mL)刺激，培養48 h，取上清，余同HaCaT細胞操作。

1.3 統計學處理

采用SPSS 17.0統計軟件進行統計學分析，用藥前后及組間配對資料應用 t檢驗，療效用 χ2檢驗，α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 對HaCaT細胞產生TARC的調控作用

HaCaT細胞培養48 h后，培養上清中產生117.01 pg/mL的TARC，10－9～10－5mol/L 的地塞米松表現出明顯抑制作用，而FK506和CX－659s未見此作用(圖1)。進一步用IFN－γ刺激HaCaT細胞，促使其產生TARC，3種藥物的作用濃度分別為10－12～10－6mol/L(地塞米松)，10－12～10－6mol/mL(FK －506)和 10－6～10－2mol/L(CX －659s)，見圖 2。

IFN－γ刺激下，HaCaT細胞產生TARC水平明顯增加，與空白對照組相比，P＜0.001;各種濃度的地塞米松作用效果雖然沒有達到空白對照組水平，但IFN－γ刺激組均顯示出抑制效果(＊＊P ＜0.01，＊＊＊P ＜0.001);各種濃度的 FK －506 作用效果雖然沒有達到空白對照組水平，但IFN－γ刺激組顯示出抑制效果(＊＊P ＜0.01，＊＊＊P ＜0.001);各種濃度的 CX －659s未見抑制效果，雖然10－2mol/L濃度作用下，TRAC產生明顯減少，但無統計學意義。

2.2 對NG1RGB細胞產生TARC的影響

NG1RGB細胞在 IL－4，TNF－α，IFN－γ作用下產生 TARC。本試驗證明，地塞米松在10－7mol/L濃度下表示輕度抑制作用(＊P ＜0.05);FK506 在 10－9～10－5mol/L 濃度未見抑制作用;CX－659s在 10－5～10－2mol/L濃度時表現出抑制作用，隨濃度增高，抑制作用相應增強。見圖3。

3 討論

圖1 對HaCaT細胞TARC表達的影響

圖2 IFN－γ刺激下，3種藥物對HaCaT細胞TARC表達的影響

圖3 IL－4，TNF－α，IFN－γ刺激下，3種藥物對 NG1RGB細胞TARC表達的影響

本試驗的目的在于研究3種免疫抑制劑抑制皮膚角質形成細胞和成纖維細胞的TARC表達的作用機制。研究結果表明，這些免疫抑制藥物能明顯地抑制TARC的表達，調節持續進行的免疫炎性反應。這些免疫抑制藥物通過皮膚的兩大結構性成分，即角質形成細胞和成纖維細胞，分別在不同條件下抑制TARC表達。筆者認為，皮膚角質形成細胞和成纖維細胞均可以誘導CCR4+T細胞趨向炎癥部位，從而調節皮膚局部病理過程中的免疫炎性反應。

本研究結果表明，HaCaT細胞培養48 h后，培養上清中產生117.01 pg/mL的TARC蛋白;IFN－γ刺激HaCaT細胞，分別產生 957.25，1 001.5，96.31 pg/mL，前兩組數據明顯高于無刺激組(P＜0.001);IL－4，TNF－α，IFN－γ 作用 NG1RGB 細胞，產生TARC 分別為 856.28，420.34 和 706.07 pg/mL，水平明顯高于無刺激的細胞[4]。ELISA數據表明，各種濃度地塞米松和FK－506可不同程度地抑制HaCaT細胞中的TARC表達(P＜0.01或 P＜0.001);同樣，CX－659s可抑制NG1RGB細胞中TARC蛋白質水平的表達(P＜0.01或 P＜0.001)，且具有濃度依賴性;地塞米松除在10－7mol/L濃度下表現出輕度抑制作用外，其他濃度和各濃度FK－506未見抑制效果。

已有研究表明，皮膚角質形成細胞和成纖維細胞在IL－4，TNF－α，IFN－γ刺激下對TARC表達的影響，不論蛋白質，還是mRNA水平均得到一致結果[4]。本試驗表明，3種免疫抑制劑分別在不同狀態下抑制皮膚角質形成細胞和/或成纖維細胞的TARC表達，而這些細胞在不同病理條件下所產生的TARC，已經有試驗報道[8－9]。

免疫抑制藥物臨床治療效果顯著，常常作為治療異位性皮炎等過敏性皮膚疾病的一線藥物。地塞米松通過含NF－AT轉錄區的RE－Ⅱ區域抑制白細胞介素5(IL－5)的表達[10]，有試驗證明地塞米松通過NF－B活性調控樹突狀細胞的分化與成熟。他克莫司受體結合蛋白(PEP－1－FK506BP)通過抑制異位性皮炎小鼠NF－B和MAPK活性，抑制細胞因子和趨化因子的表達，提示FK－506有可能為治療異位性皮炎的有效藥物[11]。CX－659s對HaCaT細胞TARC的抑制作用，是通過NF－B和STAT1的活性化起作用[12]。筆者認為，免疫抑制藥物的抑制作用，FK－506和CX－659s通過抑制NF－B的DNA結合活性，從而抑制皮膚角質形成細胞和成纖維細胞的TARC表達。

由上可知，3種免疫抑制劑作用于角質形成細胞和成纖維細胞，對TARC表達的調控作用，能夠抑制皮膚角質形成細胞和成纖維細胞的TARC蛋白質表達。角質形成細胞和成纖維細胞調控TARC啟動子活性的作用機制尚需進一步研究證實。

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