高效液相色譜法和化學發光酶免疫法測定萬古霉素的血藥濃度

王維忠，錢南萍，陳 斌，馬 瑩

(江蘇省泰州市人民醫院，江蘇 泰州 225300)

萬古霉素是一種糖肽類抗生素，對革蘭陽性菌有較強的殺菌作用，尤其適用于耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的感染[1]。萬古霉素耳毒性的發生與血藥濃度過高有關，當血藥濃度持續數天超過80 mg/L時，即會損傷聽力[2]。雖然現在萬古霉素劑量與血藥濃度的線性關系已經明確，臨床中并不需要常規進行治療藥物臨床監測，但長療程患者、劑量過大、服用藥物過多和腎功能不全者、老年患者等更易發生耳毒性，萬古霉素治療范圍較窄，因而根據患者的臨床實際情況實施個體化用藥就顯得尤其重要。治療藥物監測被認為是減少萬古霉素不良反應的工具之一，目前國內外對萬古霉素的血藥濃度監測已采用了免疫檢測法、微生物法、高效液相色譜法[3－6]等。筆者參照有關文獻，用高效液相色譜(HPLC)法和化學發光酶免疫(CLEIA)法測定萬古霉素血藥濃度，并對兩種方法的測定結果利用 t檢驗進行比較，評價兩種方法的差異。

1 儀器與試藥

HPLC系統，包括1525泵，2487型紫外可見光檢測器，Empower色譜工作站(美國Waters公司);80－2型離心機(上海手術機械廠);TGL－16C型離心機(上海安亭科學儀器廠制造);AXSYM高效能全自動免疫分析儀等。萬古霉素標準品(日本ELi LiLLy公司，批號為 H20030375，純度 99.2%);乙腈(Canada，ACETONITRILE－190)為色譜純;硫酸鋅、磷酸二氫鉀為分析純;空白血漿(泰州市中心血站提供);萬古霉素試劑盒(雅培公司)VancomycinⅡReagent Pack(Rgnt Lot:79083Q103)。

2 方法與結果

2.1 血清樣品采集

30例臨床應用萬古霉素的成年患者(萬古霉素1.0 g+5%葡萄糖250 mL恒速靜脈滴注，100～120 min內滴注完畢，每日2次，連用3 d)，靜脈滴注結束后30～60 min取前臂靜脈血3 mL離心后的血清測定峰濃度，取下一次靜脈滴注萬古霉素前30 min離心后的血清測定谷濃度。

2.2 高效液相色譜法測定血藥濃度

2.2.1 色譜條件

色譜柱:Hypersil BDS C18柱(150 mm ×4.6 mm，5.0 μm);流動相:磷酸二氫鉀(0.05 mmol/L)－乙腈(8∶92);流速:1 mL/min;檢測波長:236 nm;進樣量:20 μL。萬古霉素的檢測波長，有文獻報道采用236 nm和280 nm[7－8]，本試驗發現該藥的吸光度在236nm波長處遠大于280nm波長處，故采用236nm作為檢測波長。

2.2.2 血液樣品處理

取血漿樣品 400 μL，置 1.5 mL離心管中，加入配制好的10%硫酸鋅溶液50 μL作為沉淀劑沉淀血漿，離心(4 000 r/min)后取20 μL進樣，測定萬古霉素的峰高[5]。萬古霉素的血樣提取方法，有文獻報道采用乙腈－異丙醇(1∶1)沉淀血漿后，氯仿或二氯甲烷萃取上清液的方法進行血樣提取[3]，但此操作較煩瑣，且沉淀劑用量較大，血樣檢測靈敏度降低;本試驗采用文獻報道的以10%硫酸鋅為沉淀劑，采用一次沉淀法，提取操作簡單，沉淀較完全，且采血少(400 μL)，沉淀劑用量少(僅 50 μL)，加沉淀劑后血濃度稀釋不到20%，從而大大提高了血樣的檢測靈敏度，由于無需有機溶劑提取，提取過程中的誤差相對較少[5]。

2.2.3 系統適用性試驗

按2.2.1項下色譜條件進樣。結果表明，血漿對萬古霉素的測定無干擾，萬古霉素的保留時間為6.3 min，空白血漿、空白血漿+對照品、用藥后血漿樣品的色譜圖見圖1。

圖1 萬古霉素高效液相色譜圖

2.2.4 標準溶液配制

精密稱取萬古霉素標準品適量，精密稱定，以注射用水配成質量濃度為200 μg/mL的貯備液，再以空白血漿稀釋成5，10，20，40，60，80 μg/mL 的血漿標準溶液。

2.2.5 方法學考察

線性關系考察:取萬古霉素系列質量濃度的標準溶液，按血漿樣品處理后，取20 μL進樣，以峰高(A)對藥物質量濃度(C)作線性回歸，得線性回歸方程 A=127.37 C+228.93，r=0.999 3(n=5)。結果表明，萬古霉素在 5.0 ～80.0 μg/mL 質量濃度范圍內與峰高呈良好線性關系。

精密度試驗:取質量濃度分別為10，20，40 μg/mL的萬古霉素血漿標準溶液，1 d內重復測定5次，連續測定5 d，計算3種質量濃度日內 RSD和日間 RSD。結果見表1。

回收率試驗:取3種質量濃度的萬古霉素標準液，由標準曲線測得的各質量濃度與實際質量濃度比較，得回收率。結果見表2。

穩定性試驗:取10，20，40 μg/mL的萬古霉素血漿標準溶液各2份，其中1份室溫下保存，另1份于－20℃冷凍保存，分別于0，2，4，8，12 h時取樣測定萬古霉素的質量濃度。結果表明，萬古霉素血漿樣本在室溫和凍融條件下測定時不需要特殊保護處理，穩定性良好。

2.3 CLEIA法測定血藥濃度

取質量濃度為 0，5，10，25，50，100 μg/mL 的萬古霉素標準品，以萬古霉素試劑盒檢測，得到相應的標準曲線，運行后儀器進行自動測試和標準曲線的擬合，貯存在儀器中。精密度試驗結果、回收率試驗結果見表1和表2。

2.4 測定結果比較

30例患者血樣，用藥前后同一血樣分別采用HPLC法和CLEIA法測定血藥濃度，以CLEIA法測得的質量濃度為 X，以HPLC法測得質量濃度為 Y，得回歸方程為 Y=0.9821X+0.1760。結果，兩法測定值相關性良好(r=0.987 1)，見圖2。用配對 t檢驗兩種方法是否存在差異，結果差異無統計學意義(P＞0.05)。

3 討論

高效液相色譜法測定萬古霉素血藥濃度準確、靈敏度高，按照色譜條件操作后，出峰比較理想，色譜分離比較完全，精密度和回收率都比較好，但其操作需要專門的儀器及耗材，對試驗者的要求也較高，需要避免流動相、沉淀劑等對血清樣品的干擾，操作復雜，試驗時間較長。化學發光酶免疫分析法是一種有效的微量和痕量分析法，用化學發光劑直接標記抗原或抗體，根據化學發光體系中的光子發光強度的大小，測定微量的抗原或抗體;AXSYM高效能全自動免疫分析儀在檢測過程中采用全自動精確的加樣系統、恒溫系統、試劑冷藏系統、超聲波清洗系統、磁場分離系統和中心數據處理系統等，能減少試驗誤差，提高檢測速度。化學發光酶免疫法可同時大量地對同種藥物的血藥濃度進行監測，節約時間，提高醫院工作效率，但需要專門的試劑盒，檢測成本較高。本試驗結果顯示，兩種方法無顯著性差異，雖然各有優缺點，但兩者具有較好的相關性，測定結果并不需要相互校正，在臨床治療藥物臨測工作中可以根據監測要求和監測目的靈活運用。

表1 萬古霉素標準品的精密度試驗結果(n=5)

表2 萬古霉素標準品的回收率試驗結果(n=5)

圖2 兩種方法的相關性

[1]四川美康醫藥軟件研究開發有限公司.藥物臨床信息參考[M].重慶:重慶出版社，2008:192－193.

[2]戴自英，劉裕昆，汪 復，等.實用抗菌藥物學[M].第2版.上海:上海科學技術出版社，1998:222.

[3]豐嘉駒，顧嘉欽.高效液相色譜法測定萬古霉素血藥濃度[J].中國臨床藥學雜志，2000，9(2):107 －109.

[4]錢南萍，喬 峰，王 華，等.HPLC和微生物法測定萬古霉素血藥濃度[J].中國現代應用藥學雜志，2009，26(11):937－940.

[5]吳飛華，李允武，金芝貴，等.反向高效液相色譜法快速測定去甲萬古霉素血藥濃度[J].藥學服務與研究，2003，3(1):27－28.

[6]肖 力，任 斌、陳小陸.熒光偏振法測定去甲萬古霉素血藥濃度[J].齊齊哈爾醫學院學報，2007，28(3):315－316.

[7]張華峰，宋 青，戴 博，等，高效液相色譜法測定人血漿中萬古霉素和去甲萬古霉素的濃度[J].解放軍藥學學報，2011，27(1):66－67.

[8]焦志鐵，張樹倩.血漿去甲萬古霉素的濃度測定[J].醫藥導報，2008，27(12):1 523 －1 524.