固體脂質(zhì)納米粒作為水楊酸經(jīng)皮給藥載體的研究

王愛(ài)萍 ，高大林 ，李 艷，戚元?jiǎng)P，慕宏杰，萬(wàn) 芳

(1.煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264005; 2.加卜吉中國(guó)品質(zhì)管理中心，山東 青島 266200)

近年來(lái)，微載體透皮給藥研究取得了較大進(jìn)展。固體脂質(zhì)納米粒(solid lipid nanoparticle，SLN)以生理相容性好、體內(nèi)可降解、控釋和靶向作用明確、毒性低、適宜工業(yè)化生產(chǎn)和長(zhǎng)期保存等特點(diǎn)而日益受到重視[1]。固體脂質(zhì)納米粒用于經(jīng)皮給藥具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[2－3]，如可通過(guò)穿透、水合和融合機(jī)制透皮轉(zhuǎn)運(yùn)，較高的包封率和載藥量可保證藥物經(jīng)皮滲透時(shí)有足夠的驅(qū)動(dòng)力和透過(guò)量，以及具有封閉效應(yīng)等。水楊酸臨床上主要用于治療皮膚淺部真菌病、脂溢性皮炎等，主要?jiǎng)┬蜑檐浉鄤?。將水楊酸制成固體脂質(zhì)納米粒透皮給藥系統(tǒng)，旨在提高生物利用度，增加藥物在局部的儲(chǔ)量，并通過(guò)其緩釋特性獲得一定時(shí)間穩(wěn)定的血藥濃度，從而提高治療效能和患者依從性。筆者制備了水楊酸固體脂質(zhì)納米粒經(jīng)皮給藥系統(tǒng)，考察固體脂質(zhì)納米粒作為經(jīng)皮給藥載體的促滲作用，并與普通軟膏比較，報(bào)道如下。

1 儀器與材料

RE－3000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);SK250HP型超聲清洗器(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司);UV－2550型紫外分光光度計(jì)(日本島津公司);Angilent 1100型高效液相色譜儀;ZTY智能透皮試驗(yàn)儀(鞏義市英峪予華儀器廠);LD5－2A型低速離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)。水楊酸(北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司，批號(hào)為20070704);硬脂酸(天津市天大化工實(shí)驗(yàn)廠，批號(hào)為20050117);豆磷脂(上海太偉藥業(yè)有限公司，批號(hào)為20070509);吐溫－80(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)為F20060208);葡聚糖凝膠G－50(北京經(jīng)科宏達(dá)生物技術(shù)有限公司，批號(hào)為17－0043－02)。Wistar大鼠，合格證號(hào)為 SCXK(魯)2009－0009，購(gòu)于山東綠葉制藥有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 水楊酸固體脂質(zhì)納米粒的制備

采用薄膜超聲法制備。稱取水楊酸5 mg，硬脂酸20 mg，豆磷脂40 mg，置茄形瓶中，加10 mL氯仿超聲溶解，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，減壓回收氯仿成膜，另取5 mL吐溫－80水溶液(1%)加至已成膜的茄形瓶中，旋轉(zhuǎn)，將膜洗下，超聲處理40 min，超聲后溶液于4℃保存，即得。

2.2 水楊酸含量測(cè)定方法

2.2.1 紫外分光光度法(水楊酸固體脂質(zhì)納米粒體外評(píng)價(jià))

紫外吸收波長(zhǎng)確定:精密稱定水楊酸0.1 g，置量瓶中，以甲醇溶解并定容至刻度，精密量取0.2 mL溶液，定容至10 mL，以甲醇為空白對(duì)照，于200～400 nm波長(zhǎng)處紫外掃描。另按2.1項(xiàng)下方法制備空白及含藥固體脂質(zhì)納米粒，量取0.2 mL，置10 mL量瓶，用甲醇溶解，以甲醇為空白，在200～400 nm波長(zhǎng)處紫外掃譜。結(jié)果見(jiàn)圖1?？梢?jiàn)在296 nm波長(zhǎng)處，水楊酸有最大吸收峰，而空白固體脂質(zhì)納米粒無(wú)吸收，故選定296 nm作為水楊酸的測(cè)定波長(zhǎng)。

圖1 紫外掃描圖

線性關(guān)系考察:精密稱定水楊酸0.1 g，置100 mL量瓶中，甲醇溶解并定容，得質(zhì)量濃度為1 g/L的對(duì)照貯備液，精密吸取不同體積的上述溶液，分別用甲醇稀釋得質(zhì)量濃度為8，12，16，20，24，28，32 μg/mL的系列溶液，于296 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(A)。以吸光度為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo)繪制曲線，線性回歸方程為A=0.024 3 C+0.006 2，r=0.999 9(n=7)。結(jié)果表明，水楊酸質(zhì)量濃度在8～32 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn):取質(zhì)量濃度為20 μg/mL的對(duì)照品溶液，平行測(cè)定6次。結(jié)果吸光度的 RSD為0.2%(n=6)。

重復(fù)性試驗(yàn):取同一批水楊酸固體脂體納米粒樣品(批號(hào)為20090507)5份各0.5 mL，置10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度并測(cè)定吸光度。結(jié)果平均吸光度為0.589，RSD為1.1%(n=5)，表明方法重現(xiàn)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn):取質(zhì)量濃度為20 μg/mL的對(duì)照品溶液，于不同時(shí)間點(diǎn)(0，2，4，8，24 h)測(cè)定。結(jié)果吸光度的 RSD 為 0.7%(n=5)。

回收率試驗(yàn):精密量取空白固體脂體納米粒0.5 mL 3份，置10 mL量瓶中，分別精密加入質(zhì)量濃度約為32 μg/mL的對(duì)照品溶液 4，6，8 mL，用甲醇稀釋至刻度，配成含水楊酸 12.8，19.2，25.6 μg/mL的樣品溶液，依法測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果平均加樣回收率為 101.4%(99.1% ～102.9%)，RSD=1.5%(n=3)。

2.2.2 高效液相色譜法(動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)樣品含量測(cè)定)

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn):色譜柱為ODS C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為甲醇 － 0.2% 磷酸水溶液(55 ∶45)，流速為 1 mL/min，柱溫 25 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng):230 nm，進(jìn)樣體積 20 μL。色譜圖見(jiàn)圖1，水楊酸出峰處無(wú)雜質(zhì)峰干擾，表明該法可用于水楊酸的含量測(cè)定。

線性關(guān)素考察:精密吸取2.2.1線性關(guān)系考察項(xiàng)下對(duì)照貯備液，分別用甲醇稀釋得質(zhì)量濃度為 1，4，10，20，40，80，100 μg/mL的系列溶液，進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制曲線并進(jìn)行線性回歸，線性方程為 Y=55.406 X－0.743 2，r=0.999 9(n=7)。結(jié)果表明水楊酸質(zhì)量濃度在 1～100 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn):取質(zhì)量濃度為10 μg/mL的對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣6次。結(jié)果峰面積的 RSD為0.03%(n=6)。

重復(fù)性試驗(yàn):取同一水楊酸固體脂質(zhì)納米粒透皮試驗(yàn)樣品5份，依法測(cè)定。結(jié)果樣品中水楊酸平均質(zhì)量濃度為15.02 μg/mL，RSD為1.0%(n=5)，表明方法重現(xiàn)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn):取質(zhì)量濃度為10 μg/mL的對(duì)照品溶液，分別于0，2，4，8，24 h 時(shí)進(jìn)樣分析。結(jié)果峰面積的 RSD 為 0.3%(n=5)。

回收率試驗(yàn):精密量取空白固體脂質(zhì)納米粒0.5 mL 3份，置10 mL量瓶中，分別精密加入質(zhì)量濃度約為100 μg/mL的對(duì)照品溶液 2，4，8 mL，用甲醇稀釋至刻度，配成含水楊酸 20，40，80 μg/mL的樣品溶液，依法測(cè)定。結(jié)果平均加樣回收率為100.9%(98.6% ～102.3%)，RSD=1.1%(n=3)。

2.3 水楊酸固體脂質(zhì)納米粒包封率和粒徑測(cè)定

采用葡聚糖凝膠微柱法[4]測(cè)定包封率。取5 mL注射器兩支，去芯，分別加入4 mL葡聚糖凝膠制備微柱。分別精密量取0.2 mL水楊酸固體脂質(zhì)納米粒和水楊酸溶液，置葡聚糖凝膠微柱頂部，靜置30 min后，以磷酸鹽緩沖液進(jìn)行洗脫，洗脫液以甲醇破乳并定容至10 mL，于296 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，繪制曲線見(jiàn)圖2?？梢?jiàn)，洗脫體積至3 mL時(shí)，水楊酸可與水楊酸固體脂質(zhì)納米粒良好分離。

取 5 mL注射器，按上述方法制備葡聚糖凝膠微柱，加水楊酸固體脂質(zhì)納米粒0.2 mL后進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，甲醇破乳并定容;另精密量取水楊酸固體脂質(zhì)納米粒，甲醇破乳并定容。分別于296 nm波長(zhǎng)處測(cè)定兩者的吸光度，即 A1和 A2，計(jì)算包封率(%)=A1/A2×100%。

以電子顯微鏡觀察，制備的水楊酸固體脂質(zhì)納米粒呈較均勻的球形，測(cè)定其載藥量為 3.87%，包封率為46.4%，平均粒徑為(380±35)nm。

圖2 不同體積洗脫液吸光度曲線圖

2.4 體外透皮試驗(yàn)

大鼠乙醚麻醉后，用電動(dòng)剃毛刀及剃須刀除去腹部毛，剝?nèi)「共科つw，除去皮下脂肪組織及黏連物，生理鹽水沖洗干凈，備用。將鼠皮固定在改良的Franz擴(kuò)散池中間，角質(zhì)層面向供給室。接受室中注入30%乙醇－生理鹽水作為接受液，使液面恰好與皮膚內(nèi)層接觸。然后分別取水楊酸固體脂質(zhì)納米?；鞈乙杭八畻钏彳浉啵闷つw表面，保持恒速攪拌和37℃的水浴恒溫，分別在1，2，4，6，8，10，12，24 h時(shí)間隔取樣2 mL，同時(shí)補(bǔ)充等體積釋放液。采用高效液相色譜法測(cè)定水楊酸含量，計(jì)算累積滲透量。釋藥孔直徑為1.3 cm，釋藥面積為 1.33 cm2，接受室體積為 17.5 mL。

取經(jīng)透皮24 h后的大鼠皮膚，用生理鹽水將皮膚表面洗凈，以避免藥液對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響，沿有效透皮面積邊緣剪下有效透皮皮膚。將皮膚剪碎，勻漿機(jī)絞碎，渦旋3 min后4 000 r/min離心30 min，取上清液，用乙醚進(jìn)行萃取，共萃取3次，萃取液氮?dú)獯蹈桑状既芙?，離心后取上清液，采用高效液相色譜法測(cè)定殘余藥量。

水楊酸固體脂質(zhì)納米粒及軟膏透過(guò)大鼠皮膚累積滲透量－時(shí)間動(dòng)力學(xué)曲線圖見(jiàn)圖 3?？梢?jiàn)，1)與軟膏劑相比，固體脂質(zhì)納米粒顯著增強(qiáng)了水楊酸的經(jīng)皮透過(guò)率(P ＜ 0.05)，增滲倍數(shù)為5.87，水楊酸固體脂質(zhì)納米粒 24 h內(nèi)累積透過(guò)量達(dá) 654.3 μg/cm2、透過(guò)率達(dá)34.8% ，而普通軟膏 24 h 內(nèi)累積透過(guò)量?jī)H為 128.0 μg/cm2、透過(guò)率僅為6.2%，表明固體脂質(zhì)納米粒作為水楊酸經(jīng)皮給藥載體可有效促進(jìn)藥物的經(jīng)皮吸收;2)水楊酸固體脂質(zhì)納米粒無(wú)突釋現(xiàn)象，釋藥平穩(wěn)，表明固體脂質(zhì)納米粒作為經(jīng)皮給藥載體有較好的緩釋作用，從而使藥物在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)維持一定的有效濃度，可提高治療效能和患者依從性;3)24 h透皮試驗(yàn)后，測(cè)定水楊酸固體脂質(zhì)納米粒的皮膚殘余藥量為22.99 μg，而軟膏劑的皮膚殘余藥量?jī)H為0.84 μg，說(shuō)明固體脂質(zhì)納米粒作為水楊酸的載體可明顯提高藥物在大鼠腹部皮膚中的貯留量，增加了局部藥物濃度，提高了皮膚靶向性，從而提高了藥物治療效能。

圖3 水楊酸固體脂質(zhì)納米粒及軟膏劑經(jīng)皮滲透累積滲透量－時(shí)間曲線

3 討論

本研究結(jié)果表明，與普通軟膏劑相比，固體脂質(zhì)納米粒能顯著增強(qiáng)藥物的經(jīng)皮透過(guò)率，并有明顯的緩釋效果，有效地提高了藥物的治療效能及患者用藥的依從性;同時(shí)，固體脂質(zhì)納米粒還可增加藥物在皮膚中的局部濃度，有利于對(duì)局部炎癥和疼痛的治療。

經(jīng)皮給藥系統(tǒng)常用的促滲方式為加入各種滲透促進(jìn)劑。與促透劑作用機(jī)制不同，固體脂質(zhì)納米粒主要通過(guò)穿透、水合和融合機(jī)制透皮轉(zhuǎn)運(yùn)[5]。本研究結(jié)果表明，固體脂質(zhì)納米粒不僅能促進(jìn)水楊酸透皮吸收，而且還可增加藥物在局部的儲(chǔ)量，這可能與固體脂質(zhì)納米粒經(jīng)皮促滲機(jī)制有關(guān)。

常用的固體脂質(zhì)納米粒包封率測(cè)定方法有超速離心法[6]、葡聚糖凝膠柱法和超濾法[7]。由于脂質(zhì)納米粒的密度與水的密度非常接近，采用超速離心法時(shí)包封在納米粒內(nèi)的藥物很難與游離藥物分離;而超濾法的儀器較貴且不能反復(fù)應(yīng)用，一般不作首選。本試驗(yàn)采用葡聚糖微柱離心法測(cè)定藥物的包封率，結(jié)果表明，該法準(zhǔn)確方便、操作簡(jiǎn)單，且重現(xiàn)性好。

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