眼針對急性腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織ICAM-1表達的影響

井 歡 王守巖 王 健 王 瑩 高 原 潘 茜 于 丹 王 哲 關洪全

(遼寧中醫藥大學基礎醫學院病理教研室，遼寧 沈陽 110847)

眼針療法是我院著名老中醫彭靜山教授于70年代始創，是以眼眶周圍穴區為針刺點防治疾病的一種微針療法。臨床30余年的實際應用顯示，眼針對多種急慢性疾病具有很好的療效，特別是對急性腦缺血性疾病效果突出。細胞間黏附因子1(ICAM-1)是最重要的白細胞-內皮細胞間黏附分子之一，在腦缺血再灌注損傷中的作用成為急性缺血性腦卒中研究的熱點。近年來的研究已經證實腦缺血再灌注損傷后在缺血受損區有免疫細胞因子的過量表達和炎性細胞浸潤，過量炎癥因子的產生能加重神經細胞損傷〔1〕。本實驗通過建立大鼠急性腦缺血再灌注損傷模型，觀察眼針對腦組織ICAM-1表達的影響，旨在探討眼針治療腦缺血再灌注損傷的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 健康SPF級SD大鼠64只，雌雄不拘，體重(280±20)g，由北京維通利華實驗動物中心提供，許可證編號:SCXK(京)2007-0001。適應性喂養1 w，自由飲水，攝取標準顆粒飼料，室內溫度22℃，相對濕度45%。按隨機數字法將大鼠分為對照組、假手術組、模型組、眼針組，每組16只。

1.2 方法

1.2.1 模型制備與評價 參照文獻〔2〕，模型組及眼針組采用改良的線栓法復制大鼠大腦中動脈缺血再灌注損傷模型。具體步驟:在室溫 (22℃)條件下，大鼠用 10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉后，仰臥固定于手術臺上，頸部消毒后正中偏右0.5 cm處縱向切開2 cm切口，分離右側頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)、頸內動脈(ICA)。其中ECA需暴露出3～5 mm，ICA需分離至翼腭動脈。在ECA遠端距CCA分叉處3～5 mm處結扎ECA，注意結扎用的手術線不要剪斷。再用電凝器在結扎點遠心端電凝ECA，用眼科手術剪在結扎點和電凝點之間剪斷ECA。然后將ECA向鼠尾方向牽拉，使ECA和ICA成一條直線。動脈夾夾閉CCA近心端和ICA遠心端，在ECA結扎點前端剪一“V”形小口，緩慢將栓塞線經ECA插入ICA，打開ICA遠心端的動脈夾。栓塞線插入深度1.8～2.2 cm。結扎ECA，逐層縫合。正常組未做處理。假手術組術式同模型組、眼針組，僅未插入釣魚線。模型組、眼針組于缺血2 h進行再灌注，再灌注后72 h進行神經功能缺損評分。模型的評價參照ZeaLonga 5分制評分標準:0分為無癥狀;1分為不能完全伸展對側前爪;2分為向對側轉圈;3分為向對側傾倒;4分為不能自發行走，意識喪失。評分為1～3分者納入實驗組，未達標準者排除。

1.2.2 眼針取穴及刺法 取13 mm毫針，眼針組于大鼠眶周2 mm 處針刺，定位參照人體取穴方法〔3，4〕，取肝區、上焦區、下焦區、腎區，見圖1。針刺手法:從眼眶邊緣1 mm部位平刺，左眼按照順時針方向，右側按逆時針方向，從該穴區起始定位線向終止定位線進針，進行平刺操作，刺入真皮，達到皮下組織，進針3 mm，到終止定位線為止。留針20 min，留針10 min時用刮柄進行刮針1次，刮針5下。治療時機:眼針組于腦缺血再灌注即刻及取材前30 min分別進行眼針治療2次。正常組、假手術組和模型組無其他處理。

1.2.3 試劑 實時熒光定量PCR試劑盒購自TaKaRa大連寶生物。ICAM-1引物由北京華大基因公司合成。親和純化兔抗鼠ICAM-1多克隆抗體、二氨基聯苯胺(DAB)染色試劑均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2.4 指標測定 腦組織形態學觀察:10%水合氯醛(3.5 ml/kg體重)腹腔麻醉，開胸暴露心臟，先以0.9%生理鹽水200 ml灌至無血色后，再更換4%多聚甲醛200 ml進行灌注。開顱取腦，后固定于同一固定液中6 h，腦組織取材參照腦立體定位圖譜，以Bregma點前后各0.2 mm為取材區間，常規脫水、石蠟包埋。將包埋的蠟塊作5 μm切片，蘇木素-伊紅(HE)染色將石蠟切片，常規脫蠟、乙醇梯度脫水、HE染色，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察。

圖1 大鼠眼針取穴示意圖

腦組織ICAM-1蛋白表達(免疫組化SABC):將上述石蠟切片按免疫組化試劑盒操作。ICAM-1以細胞膜或細胞質內出現清晰棕褐色顆粒為陽性。使用BI2000醫學圖像分析系統對采集的圖像測定陽性反應物的灰度，每例動物隨機取3～4張切片，且各組所選部位相同。

腦組織ICAM-1蛋白表達(Western印跡法):以上述方法麻醉后斷頭取右腦梗死區半暗帶，按腦組織凈重∶裂解液=1∶10的比例，加入相應體積的裂解液，pH7.5，將樣品剪碎后勻漿、離心，上清即為總蛋白。兔抗鼠ICAM-1一抗(1∶500);O-dianidine，β-naphthyl acid phosphate顯色;掃描儀掃描硝酸纖維素膜(NC膜)，分析結果。

腦組織ICAM-1 mRNA的表達:采用RQ-PCR方法，ICAM-1上游引物:5'CAAACGGGAGATGAATGG 3';下游引物:5'CACGAAGCCCGCAAT3'。β-actin為內參，其上下游引物分別為:5'CGTGCGTGACATTAAAGAG 3'，5'TTGCCGATAGTGATGACCT 3'。所有的產物在ABI Prism 7500 HT序列檢測系統中運行。讀取CT值，以管家基因β-actin為內參，以擴增倍數作為比較的依據，△CT=CT目的基因 -CTβ-actin，△△CT=△CT實驗-△CT對照，擴增倍數=2-△△CT。將所擴增的PCR產物同時進行溶解曲線分析。

1.3 統計學方法 應用SPSS11.5統計軟件，實驗數據采用±s表示，組間比較采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 眼針對急性腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織形態結構的影響 正常組及假手術組大鼠皮層組織細胞排列有序，細胞結構完整，核清楚，組織間隙無異常。模型組神經細胞數量明顯減少，可見篩網狀壞死灶，壞死灶周圍部分區域胞體增大，染色變淡，細胞周圍水腫明顯，組織結構疏松，可見中性粒細胞浸潤。眼針組缺血神經元數目減少，組織結構水腫減輕，中性粒細胞浸潤較模型組減少。

2.2 眼針對急性腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織ICAM-1蛋白表達的影響 采用免疫組化方法，模型組右側額頂葉腦組織ICAM-1陽性細胞較正常組和假手術組增加，而眼針組ICAM-1陽性細胞較模型組減少(P＜0.01)。采用Western印跡方法，模型組腦組織ICAM-1蛋白表達明顯高于正常組和假手術組，眼針組ICAM-1蛋白表達明顯低于模型組(P＜0.01)。見圖2，表1。

圖2 眼針對急性腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織ICAM-1蛋白表達的影響(SABC法，×400)

表1 眼針對急性腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織ICAM-1蛋白表達影響(±s，n=8)

表1 眼針對急性腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織ICAM-1蛋白表達影響(±s，n=8)

與正常組比較:1)P＜0.01;與模型組比較:2)P＜0.01

組別 免疫組化法(灰度值) Western法(灰度值)114.78±13.54 0.35±0.02假手術組 121.65±12.55 0.37±0.04模型組 157.36±15.13 0.60±0.041)眼針組 136.41±19.382) 0.52±0.042)正常組

2.3 眼針對急性腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織ICAM-1 mRNA表達的影響 選用β-actin作為內參，ICAM-1基因擴增產物大小為86 bp，β-actin基因擴增產物為132 bp。模型組腦組織ICAM-1 mRNA表達(3.9±0.37)較正常組(1.00±0.09)、假手術組(1.46±0.26)增加，眼針組表達(1.8±0.23)較模型組減少，均有顯著差異(P＜0.01)。

3 討論

眼針療法是彭靜山教授根據中醫學“諸經皆屬于目”以及在后世醫家的“五輪”“八廓”理論基礎上，結合“八卦”學說，按照八卦方位將眼眶四周分為等份的八個區，每個區代表一個卦位，即乾、坎、艮、震、巽、離、坤、兌;在八區的基礎上再依據經絡臟腑的聯屬關系配以臟腑穴區，總計十三穴區，即肺穴、大腸穴、腎穴、膀胱穴、上焦穴、肝穴、膽穴、中焦穴、心穴、小腸穴、脾穴、胃穴、下焦穴〔5〕。腦為奇恒之府，腦由髓匯集而成，故名“髓?！?，腦是精髓和神明高度匯集之處，有元神之府。眼與腦密切相連。……目形類丸，……內有大絡六，謂心、肺、脾、肝、腎，命門各主其一;中絡八，謂膽、胃，大小腸，三焦、膀胱各主其一;外有旁支細絡莫知其數，皆懸貫于腦……〔6〕。說明眼通過經絡與腦密切相連。在辨證基礎上選取相應穴位進行針刺，從而達到“通經調氣血”以防治疾病的效果。30余年來臨床上運用眼針治療重疾頑癥，特別是對急性腦卒中癱瘓的療效尤為明顯。

ICAM-1屬免疫球蛋白超家族成員，與白細胞的浸潤關系密切，可促進炎癥反應的發生。ICAM-1介導白細胞與血管內皮細胞之間的黏附及白細胞穿過血管壁這一復雜過程。正常情況下ICAM-1可以在內皮細胞有低水平的表達，不會引起機體的病理性損傷;而在腦缺血等病理情況下，在細胞因子如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1(IL-1)等刺激下表達可明顯升高，一旦缺血區域血流恢復，ICAM-1即可作為配基與白細胞上表達的淋巴細胞功能相關抗原-1(LFA-1)和巨噬細胞活化趨化因子-1(Mac-1)結合，使大量白細胞與微血管內皮細胞發生黏附，且穿越血管內皮細胞到達周圍組織產生炎癥反應，進而引起一系列的病理變化，導致再灌注損傷〔7，8〕。本實驗結果顯示模型組大鼠腦組織ICAM-1蛋白和基因表達均較正常組、假手術組升高，同時神經功能缺損癥狀加重，說明ICAM-1參與了腦缺血再灌注損傷。而眼針治療后ICAM-1蛋白和基因表達均較模型組下降，說明眼針能減少腦缺血再灌注損傷大鼠ICAM-1表達。即通過眼針治療可以有效地減少腦梗死區ICAM-1的表達，通過減輕炎癥反應實現對腦細胞損傷的保護作用。

1 Merrill JE，Benveniste EN.Cytokines in inflammatory brain lesions:helpful and harmful〔J〕.Trends Neurosci，1996;19(18):331-8.

2 馬賢德，孫宏偉，柴繼嚴，等.線栓法制備大鼠腦缺血再灌注模型的方法研究〔J〕.中華中醫藥學刊，2009;27(6):1200-1.

3 彭靜山.眼針療法〔M〕.沈陽:遼寧科學技術出版社，1990:11.

4 田維柱.中華眼針〔M〕.沈陽:遼寧科學技術出版社，1998:78-88.

5 董文毅，彭 敏.眼針療法的研究進展〔J〕.針灸學報，1991;3(1):48-51.

6 明·王肯堂.證治準繩〔M〕.北京:中國中醫藥出版社，1997:226.

7 Rigsby CS，Ergul A，Portik-Dobos V，et al.Dorrance.Effects of spironolactone on cerebral vessel structure in rats with sustained hypertension〔J〕.Am J Hyperten，2011;24(6):708-15.

8 Ishida H，Takemori K，Dote K，et al.Expression of glucose transporter-1 and aquaporin-4 in the cerebral cortex of stroke-prone spontaneously hypertensive rats in relation to the blood-brain barrier function〔J〕.Am J Hyperten，2006;19(1):33-9.