肺氣腫小鼠骨骼肌、心肌γ-GCS表達(dá)變化

汪金峰 李云橋 (華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院老年科，湖北 武漢 430022)

肺氣腫小鼠骨骼肌、心肌γ-GCS表達(dá)變化

汪金峰 李云橋 (華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院老年科，湖北 武漢 430022)

目的 探討γ谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)在肺氣腫小鼠骨骼肌、心肌中的表達(dá)變化與細(xì)胞凋亡的關(guān)系。方法 采用單純熏香煙法制作肺氣腫小鼠模型。運(yùn)用TUNEL法檢測(cè)骨骼肌、心肌細(xì)胞凋亡，免疫組化技術(shù)檢測(cè)上述組織γ-GCS的蛋白水平，結(jié)果以平均光密度值表示。結(jié)果 肺氣腫小鼠骨骼肌心肌細(xì)胞凋亡均增加(0.20±0.07 vs 0.36±0.04，t=－4.583，P=0.001;0.20±0.02 vs 0.29±0.07，t=－3.433，P=0.009)。肺氣腫小鼠骨骼肌、心肌γ-GCS的蛋白水平分別為0.210±0.026、0.38±0.09，與正常組骨骼肌、心肌γ-GCS的蛋白水平0.086±0.008、0.19±0.03相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.917，P＜0.001，t=－4.616，P=0.001);肺氣腫小鼠骨骼肌與心肌γ-GCS蛋白水平相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=－4.092，P=0.014)。結(jié)論 肺氣腫小鼠骨骼肌、心肌細(xì)胞凋亡增加，其機(jī)制可能與γ-GCS介導(dǎo)的氧化/抗氧化失衡有關(guān)，骨骼肌較心肌細(xì)胞凋亡加重，可能與γ-GCS表達(dá)減少有關(guān)。

肺氣腫;γ谷氨酰半胱氨酸合成酶;小鼠;骨骼肌

目前關(guān)于肺氣腫的發(fā)病機(jī)制學(xué)說(shuō)主要有:氧化/抗氧化失衡、蛋白酶/抗蛋白酶失衡以及慢性氣道和肺部炎癥形成〔1〕等。研究表明，氧化應(yīng)激產(chǎn)生的活性氧是造成多系統(tǒng)、多器官氧化損傷的共同基礎(chǔ)。還原型谷胱甘肽(GSH)是細(xì)胞內(nèi)外主要的抗氧化劑，對(duì)維護(hù)組織細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)、功能及代謝起重要作用。γ谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)是GSH生物合成中的關(guān)鍵酶〔2〕。已有研究表明:γ-GCS高表達(dá)于慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者肺泡和支氣管上皮細(xì)胞中〔3〕。為進(jìn)一步探討γ-GCS對(duì)全身其他器官的影響，本文就肺氣腫小鼠模型骨骼肌、心肌組織中γ-GCS的表達(dá)變化與細(xì)胞凋亡的關(guān)系進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 免疫組織化學(xué)試劑盒購(gòu)自北京中杉公司;γ-GCS抗體為美國(guó)Santa Crus公司產(chǎn)品。

1.1.2 動(dòng)物模型和標(biāo)本采集 雄性昆明種小鼠，體質(zhì)量24～26 g(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物研究所提供)，分為正常對(duì)照組(10只)及肺氣腫組(20只)。肺氣腫組制模采用單純熏香煙法〔4〕，以常規(guī)飼料喂養(yǎng)小鼠，吸煙時(shí)動(dòng)物置于帶有透氣孔的玻璃箱內(nèi)，每次通過(guò)吸煙器燃燒5根去過(guò)濾咀的紅雙喜牌香煙(焦油含量每支13 mg，煙霧煙堿每支1.3 mg)，使動(dòng)物暴露于煙霧中被動(dòng)吸煙，每周吸煙6 d，每日吸煙2次，每次約1～1.5 h。16 w后，頸椎脫臼法處死動(dòng)物，取出趾長(zhǎng)肌、心肌組織，于10%甲醛溶液固定，采用免疫組織化學(xué)染色。

1.2 方法

1.2.1 肺組織切片的制作 熏香煙16 w后，頸椎脫臼法處死動(dòng)物，迅速開(kāi)胸，小心取出肺組織，在肺葉中線矢狀面切取肺組織并以石蠟包埋，制作6 μm厚的切片，并用HE染色。

1.2.2 骨骼肌、心肌γ-GCS蛋白表達(dá)及細(xì)胞凋亡測(cè)定 蛋白表達(dá)采用親合素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物法(ABC)免疫組織化學(xué)染色試劑盒，根據(jù)試劑盒提供的操作說(shuō)明進(jìn)行;細(xì)胞凋亡用末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)檢測(cè)，圖像經(jīng)HMIAS-2000型全自動(dòng)醫(yī)學(xué)彩色圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)資料以±s表示，兩組計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 肺氣腫小鼠模型肺組織病理特點(diǎn) 在肺組織切片中，可見(jiàn)肺氣腫模型小鼠肺泡間隔變薄甚至斷裂，多個(gè)肺泡融合形成肺大泡，呈現(xiàn)肺氣腫樣特征改變，而正常對(duì)照組小鼠各肺泡壁連接清楚，肺泡大小均一，未見(jiàn)明顯肺泡融合，見(jiàn)圖1。

2.2 骨骼肌心肌組織內(nèi)γ-GCS蛋白表達(dá)及細(xì)胞凋亡的變化以辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗顯示正常組及肺氣腫組骨骼肌、心肌組織內(nèi)γ-GCS蛋白表達(dá)，在肺氣腫組與底物大量結(jié)合，顯示明顯的棕黃色，而正常組棕黃色底物明顯減少，見(jiàn)圖2。肺氣腫小鼠骨骼肌心肌細(xì)胞凋亡均增加(P=0.005)。肺氣腫小鼠骨骼肌、心肌γ-GCS蛋白水平與正常組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。肺氣腫小鼠骨骼肌與心肌γ-GCS蛋白水平相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.014)。見(jiàn)表1。

TUNEL法檢測(cè)顯示棕黃色底物在肺氣腫組骨骼肌、心肌組織切片中明顯增多，而正常組骨骼肌、心肌組織切片中較少看到，細(xì)胞凋亡程度與棕黃色底物濃度呈正相關(guān)，見(jiàn)圖3。

圖1 兩組小鼠肺組織病理特點(diǎn)(HE，×200)

圖2 正常組及肺氣腫組骨骼肌、心肌組織內(nèi)γ-GCS蛋白表達(dá)(免疫組化，×400)

圖3 正常組及肺氣腫組骨骼肌、心肌組織內(nèi)細(xì)胞凋亡(免疫組化，×400)

表1 兩組骨骼肌、心肌凋亡及γ-GCS蛋白表達(dá)(±s，n=20)

表1 兩組骨骼肌、心肌凋亡及γ-GCS蛋白表達(dá)(±s，n=20)

組別 骨骼肌凋亡 γ-GCS心肌凋亡 γ-GCS正常組0.20±0.07 0.086±0.008 0.20±0.02 0.19±0.03肺氣腫組 0.36±0.04 0.210±0.026 0.29±0.07 0.38±0.09t值 －4.583 7.917 －3.433 －4.616P值0.001 ＜0.001 0.009 0.001

3 討論

氧化應(yīng)激在調(diào)節(jié)細(xì)胞功能及維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)中具有重要作用。低水平的氧化應(yīng)激介導(dǎo)細(xì)胞的生長(zhǎng)和細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)〔5〕。但過(guò)高的氧化應(yīng)激水平又可導(dǎo)致疾病的發(fā)生，如肺氣腫。氧化劑對(duì)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的影響主要位于含酪氨酸的受體和酶的轉(zhuǎn)錄后修飾水平，從而損害結(jié)構(gòu)蛋白、脂質(zhì)和DNA，并最終誘發(fā)凋亡。研究顯示，凋亡細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平增加〔6〕，與凋亡之間存在著惡性循環(huán)。

γ-GCS能被氧化劑、炎癥介質(zhì)、抗炎因子、抗腫瘤藥物、重金屬等激活，在調(diào)控內(nèi)源性抗氧化劑GSH的合成中扮演關(guān)鍵性的作用〔7〕。前期研究發(fā)現(xiàn):正常情況下，肝、肺以及腎組織均有一定量的γ-GCS基因表達(dá);在肺氣腫狀態(tài)下，肺組織中γ-GCS的基因表達(dá)更為明顯〔2〕。本研究中發(fā)現(xiàn)骨骼肌、心肌中也有γ-GCS的表達(dá)，尤其是在肺氣腫狀態(tài)下，其表達(dá)明顯增加。γ-GCS表達(dá)增加是機(jī)體通過(guò)增強(qiáng)抗氧化能力，從而達(dá)到降低氧化性損傷的一種自我防護(hù)反應(yīng)〔8〕。本研究結(jié)果也證實(shí)，模型小鼠心肌γ-GCS含量較骨骼肌表達(dá)增多，而心肌凋亡程度卻較骨骼肌凋亡程度輕。因此，骨骼肌是較心肌更易受損傷的部位，可能是肺氣腫患者容易出現(xiàn)骨骼肌萎縮和功能紊亂的重要機(jī)制之一。

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7 林書(shū)典，戴愛(ài)國(guó).γ-GCS和慢性阻塞性肺疾病〔J〕.國(guó)外醫(yī)學(xué)·呼吸系統(tǒng)分冊(cè)，2004;24(6):391-4.

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〔2012-02-29收稿 2012-03-12修回〕

(編輯 袁左鳴)

R56

A

1005-9202(2012)17-3721-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.17.049

汪金峰(1963-)，男，主治醫(yī)師，主要從事老年醫(yī)學(xué)及呼吸病學(xué)研究。