孔雀石綠脫色菌的分離鑒定及降解特性研究

曾慶龍， 周元祥， 劉 秀， 葉紅曼

（合肥工業大學 資源與環境工程學院，安徽 合肥 230009）

隨著染料工業的迅速發展，染料品種和數量日益增加，它們不僅具有特定的顏色，而且結構復雜，生物可降解性較低，大多具有潛毒性特征［1］。在染料家族中，三苯甲烷染料是僅次于偶氮染料的一個大類，被廣泛地應用于紡織印染、醫藥、造紙和制革等工業［2］。孔雀石綠是一種有毒的三苯甲烷類人工合成有機化合物，既可用作生物染色劑及絲綢、皮革和紙張等的染料，也可用來治理魚類或魚卵的寄生蟲、真菌或細菌感染等，但是孔雀石綠具有高毒素、高殘留和致癌、致畸、致突變等副作用［3－4］，已被列為水產養殖禁用藥物。因此，尋找對這類染料的特定降解菌成為人們爭相關注的焦點問題［5－9］。本文研究實驗室分離鑒定的3種菌株對孔雀石綠的降解特性，以進一步豐富孔雀石綠染料廢水脫色處理的微生物資源，為孔雀石綠染料廢水生物脫色問題提供理論資料。

1 材料與方法

1.1 菌種來源及染料

（1）菌種：從實驗室ABR反應器中的活性污泥混合液中分離。

（2）染料：孔雀石綠，分析純，λmax＝616nm。

1.2 培養基

（1）LB培養基：蛋白胨10g，NaCl 5g，酵母膏5g，蒸餾水1L，pH 7.0～7.2。

（2）選擇培養基：C6H12O61.5g，（NH4）2SO40.5g，NaCl 1g，KH2PO42.65g，Na2HPO4·12H2O 4.26g，MgSO4·7H2O 0.2g，FeSO4·7H2O 0.01g，CaCl20.02g，MnSO4·7H2O 0.002g，孔雀石綠60mg，蒸餾水1L，pH 7.0～7.2。

1.3 菌株分離與鑒定

將ABR反應器中采集的活性污泥混合液，在固體基礎培養基平板上進行稀釋涂布，再反復進行劃線分離，獲得純菌株，將純化后的菌株接入液體培養基中（染料質量濃度60mg／L，每支試管裝10mL脫色培養基，每株菌株接3管做3次平行試驗），30℃培養一定時間，篩選出能對孔雀石綠脫色的菌株。根據細菌分類鑒定標準［10］，從菌株個體形態特征、菌落特征等方面進行初步鑒定。菌株通過16SrDNA基因序列比對，對分離菌株進行系統分類鑒定。

1.4 脫色效果測定

從脫色培養液中取出5mL樣液，以6000r／min的轉速離心15min，緩緩傾倒出上清液，以未加染料的液體培養基為參比，測量上清液在染料最大吸收波長（λ＝616nm）處吸光度值，計算染料去除率［11］。

染料去除率＝（A0－Ae）／A0×100%，其中，A0為未接種微生物的空白對照樣品的染料溶液吸光度；Ae為離心去除菌體后的上清液中殘留染料的吸光度。

2 結果與分析

2.1 脫色菌的分離鑒定

用富集培養基進行5代的馴化培養，然后在固體培養基上經過多次劃線分離，得到對孔雀石綠染料有脫色能力的菌株。將菌株接種于LB培養基、30℃恒溫培養24h活化，活化后細菌懸液調整至吸光度A600＝0.6±0.05，取5mL菌液，將其加入50mL含60mg／L孔雀石綠染料的無機鹽培養基中，30℃的恒溫培養箱里靜置培養，測定其脫色能力。

不同菌株對孔雀石綠染料的脫色率如圖1所示，可以看出菌株 MG－2、MG－6和 MG－7對孔雀石綠脫色非常明顯，脫色率均在94%以上。

3株菌對孔雀石綠染料的脫色過程如圖2所示。結果表明，經過64h脫色，3株菌對孔雀石綠脫色非常明顯，脫色率在94%以上，而菌株MG－2和菌株MG－7在24h內對孔雀石綠的脫色率超過82%，36h的去除率超過94%。菌株MG－6在36h內對孔雀石綠的脫色效率也能達到80%，48h的去除率達到91.71%。

圖1 不同菌株對孔雀石綠的脫色率

圖2 單菌株對孔雀石綠染料的脫色過程

觀察菌株 MG－2、MG－6和 MG－7在營養瓊脂培養基上的菌落形態特征，其結果見表1所列。將各菌株進行PCR擴增，擴增產物送交測序公司進行基因測序，獲得各菌株分別從8F和1492R兩端的測序結果，使用DNAStar軟件包中的SeqMan軟件將兩側序列進行拼接，并舍去兩端可信度不高的片段，將可信度較高的片段（約1300bp）提交至NCBI網站進行序列比對，根據比對結果確定這3株菌的菌屬，結果見表2所列。

表1 菌株形態觀察結果

表2 16SrDNA基因測序結果（相似率均在98%以上）

2.2 菌株脫色性能研究

工業實際廢水成分復雜，治理過程中存在許多限制因素，研究選用最顯著的影響因子pH值、鹽度、溫度及氧氣，觀察染料孔雀石綠脫色率。

2.2.1 pH值對菌株脫色的影響

實驗設計環境pH 值為5、6、7、8、9下，3株菌對60mg／L染料孔雀石綠的脫色效果。首先，配置無機鹽培養基分裝50mL三角瓶，滅菌后用5mol／L鹽酸和2mol／L氫氧化鈉溶液調節pH值分別為5、6、7、8、9?；罨囵B3株菌24h，以10%接種量接種于滅菌無機鹽培養基中，30℃恒溫培養，從12h起每6h取樣測定離心后上清液在616nm處吸光度值，實驗結果如圖3所示。

由圖3可知，3株單菌在中性條件下脫色效果最好，在偏堿性（pH＞7）條件下具有較高的脫色率，在偏酸性（pH≤6）條件下脫色率較低。菌株MG－7對pH值的適應范圍較廣，但其脫色過程存在較為明顯的停滯現象，0～24h的脫色效果均不明顯，24h后脫色效果明顯上升。菌株MG－6和MG－2在處理孔雀石綠染料時停滯期相對較短，pH值在5～6時，基本無脫色效果；在pH＝7時，24h染料的脫色率達到95%；pH值在8～9時，菌株MG－2初始脫色率較高，但48h后，菌株 MG－6的脫色率高于菌株 MG－2，pH＝8時菌株MG－6的脫色率達到89.5%。

圖3 pH值對脫色率的影響

2.2.2 溫度對菌株脫色的影響

不同的環境溫度影響菌體酶的活性而影響菌株對染料的脫色效果。本研究考察菌株在10、20、30、37、45、55℃條件下對60mg／L染料孔雀石綠的脫色效果的影響?；罨囵B3株菌24h，以10%接種量接種于含60mg／L孔雀石綠的滅菌無機鹽培養基中，分別置于實驗所需溫度的恒溫培養箱靜置培養，從12h起每6h取樣測定離心后上清液在616nm處吸光度值，實驗結果如圖4所示。

從圖4可以看出，溫度對菌株對染料孔雀石綠的脫色有明顯的影響，在低溫條件下（θ≤10℃）3，株菌對孔雀石綠均無明顯脫色作用，隨著溫度升高，3株菌對孔雀石綠的脫色率先增大后減小，3株菌的最適脫色溫度均為30℃。菌株MG－2和菌株 MG－6對溫度的適應能力較好，在20～37℃范圍內都有較高的脫色效率，菌株MG－2的脫色要快于菌株MG－6；菌株MG－7對溫度的適應能力相對較差，只在溫度為30℃時具有較高的脫色效率，在溫度較低或較高時脫色效率都較差，其脫色過程中存在一個明顯的停滯期（0～24h），24h后細菌將染料迅速降解。

圖4 溫度對脫色率的影響

2.2.3 氧氣條件對菌株脫色的影響

本研究考察菌株在好氧、厭氧及兼氧條件下對60mg／L染料孔雀石綠的脫色效果的影響。活化培養3株菌24h，以10%接種量接種于滅菌無機鹽培養基中，提供不同氧氣條件，于30℃恒溫靜置培養48h，從12h起每6h取樣測定離心后上清液在616nm處吸光度值，結果如圖5所示。

圖5 氧氣對脫色率的影響

從圖5可見，3株菌在好氧條件下對孔雀石綠的脫色率均較低，在厭氧和兼氧條件下的脫色率明顯高于好氧條件。菌株MG－6在3種氧氣條件下都有較高的脫色率，在厭氧和兼氧條件下的脫色過程相似，脫色效率超過95%，在好氧條件的脫色率也超過70%；菌株MG－2在厭氧和兼氧條件的脫色過程基本相同，脫色效率都超過96%，而在好氧條件下脫色率只有51%；菌株MG－7最適宜在兼氧條件下對孔雀石綠進行脫色降解，在厭氧條件下的脫色效果明顯下降，在好氧條件下基本無脫色。同時，還可以發現菌株對染料的脫色速率存在差異：菌株 MG－2＞菌株MG－6＞菌株 MG－7。菌株 MG－2經活化后能立即對孔雀石綠進行降解脫色，而菌株MG－7經活化后接種到染料廢水中，需要24h的停滯期才開始對染料進行降解脫色，菌株MG－6的停滯期介于兩者之間。

2.2.4 鹽度對菌株脫色的影響

鹽度對微生物的生長繁殖和污染物的降解有著重要影響，耐鹽菌具有特殊結構及理化性質，在高鹽污染料廢水的處理方面發揮著重要作用。以NaCl作為鹽度表征，考察NaCl質量濃度為5、10、20、30、40、50g／L的條件下，對60mg／L孔雀石綠染料的脫色效果?；罨囵B3株菌24h，以10%接種量接種于滅菌無機鹽培養基中，30℃恒溫靜置培養48h，從12h起每6h取樣測定離心后上清液在616nm處吸光度值，實驗結果如圖6所示。

從圖6中可以看出，菌株MG－7具有較好的耐鹽性，菌株 MG－2和菌株 MG－6對鹽度的適應性比菌株 MG－7差，隨著ρ（NaCL）的增加，菌株對染料的脫色率出現一定程度的下降。ρ（NaCL）在10g／L以下時，鹽度對菌株MG－2的脫色效果基本無影響，12h的脫色率已達到53.6%，18h后基本保持在90%以上的脫色率；ρ（NaCL）在30g／L以下時，鹽度對菌株 MG－2脫色有一定程度的影響，起始脫色率降低，經過48h的處理最終脫色率趨于平穩，為82.4%；ρ（NaCL）在40～50g／L時，鹽度對菌株MG－2脫色有明顯的抑制作用，初始基本無脫色作用，隨著時間的延長，最高脫色率為56.4%。ρ（NaCL）在10g／L以下時，菌株MG－6對染料的脫色延遲于菌株MG－2，30h后對孔雀石綠的脫色率也在90%以上；ρ（NaCL）在30g／L以下時，鹽度對菌株 MG－6脫色的影響基本上與菌株 MG－2類似；ρ（NaCL）為40g／L時，雖然脫色比較緩慢，但保持上升態勢；ρ（NaCL）為50g／L時，菌株 MG－6對孔雀石綠的脫色有較明顯的抑制作用，起始脫色速率較快，但24h后脫色率穩定在50%左右。ρ（NaCL）為5～50g／L時，鹽度對菌株MG－7的脫色沒有明顯影響，初始脫色率有一定差異，但30h后脫色率都保持在90%以上。上述結果說明3株菌都有一定的耐鹽能力，其中菌株MG－7對鹽度的適應性最強。根據文獻［16］對耐鹽菌的劃分，3株菌都屬于耐鹽菌類型，這對實際污染廢水處理有重要意義。

圖6 鹽度對脫色率的影響

2.3 脫色降解酶初步分析

將3株菌接種于無機鹽培養基中培養，待48h完全脫色后，進行3組實驗。第1組實驗為取20mL含孔雀石綠無機鹽培養基直接加入此培養液20mL；第2組實驗為將此培養液離心，取上清液20mL，加入等體積含孔雀石綠無機鹽培養基；第3組實驗為將離心后沉淀的菌體用不含孔雀石綠的pH＝7磷酸緩沖液洗3次，再加入20 mL含孔雀石綠無機鹽培養基以及20mL不含孔雀石綠無機鹽培養基。3組實驗均在30℃條件下，重復3次，其脫色率見表3所列。

實驗結果表明：在第1組和第2組實驗中，菌株對于孔雀石綠染料的脫色綠均超過90%，第3組實驗菌株對染料無脫色。這說明孔雀石綠降解酶主要存在于培養液中，屬于胞外酶。

表3 菌體或上清液對脫色率的影響 %

3 結 論

（1）通過馴化培養和多次劃線分離，得到對孔雀石綠染料有高效脫色能力的菌株，16SrDNA基因序列比對結果表明3株高效脫色菌分屬En－terobacter asburiae（MG－2）、Escherichia coli（MG－6）和Enterobacter ludwigii（MG－7）。3株菌都能有效降解孔雀石綠染料，48h對60mg／L孔雀石綠的脫色率達到97%。

（2）3株菌對孔雀石綠的最適脫色條件為：pH＝7.0，溫度為30℃，兼性厭氧，且對鹽度都有一定的耐適性，屬于耐鹽菌。

（3）在脫色過程中，菌株 MG－2基本不出現停滯期，菌株 MG－7存在24h的停滯期，菌株MG－6的停滯期時間介于兩者之間。

（4）通過對孔雀石綠染料降解過程的研究，發現孔雀石綠降解酶主要存在于培養液中，屬于胞外酶。

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