Cx36在癲持續狀態大鼠海馬神經元的表達

戴珍祥 高志偉

1）南京市六合區人民醫院神經內科 南京 211500 2）南通大學附屬醫院神經內科 南通 226000

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 實驗動物與分組：健康雄性SD大鼠由南通大學實驗動物中心提供，共36只，6～8周齡，體質量（250±20）g，隨機分為生理鹽水組、喹啉組、辛醇組，每組12只大鼠。

1.1.2 試劑與儀器：氯化鋰、匹羅卡品、喹啉、辛醇（美國Sigma公司）；兔抗大鼠Cx36多克隆抗體、熒光標記Cx36抗體（北京博奧生生物技術公司）；二抗（碧云天生物技術公司）；冰凍切片機，正置顯微鏡（德國Leica公司）；電泳儀（美國Bio－Rad公司）。

1.2方法

1.2.1 動物模型制備與處理：氯化鋰－匹羅卡品誘導的癲大鼠模型是參照Glien［4］提出的方法，稍作改良后建立的。將大鼠適應性飼養3d，觀察大鼠飲食活動正常后稱重，將大鼠腹腔注射氯化鋰125mg／kg預處理，間隔18～24h后給予匹羅卡品60mg／kg腹腔注射，30min后觀察大鼠癲發作程度，達到Racine評分4級及以上的大鼠進入癲持續狀態（SE）。模型制備成功30min后分別予以各組大鼠腹腔注射喹啉（60mg／kg）、辛醇（60mg／kg）及等量生理鹽水。

1.2.2 Racine評分：根據 Racine［5］制定的標準判斷是否有癲發作行為：0級（0分），無任何癲發作；1級（1分），嘴及面部陣攣，咀嚼，哈欠；2級（2分），1級基礎上出現點頭，面部抽搐，頸部肌肉抽動；3級（3分），2級基礎上出現前肢或后肢抽搐；4級（4分），3級基礎上出現后肢站立，身體突然立起；5級（5分），4級基礎上出現四肢節律性抽動，下肢強直伴全身背曲或抽動，跌倒。分別對各組癲持續狀態大鼠模型及給藥后30min、1h、2h及3h時進行Racine評分。

1.2.3 Cx36表達檢測：各組大鼠分別于給藥后2h進行海馬Cx36表達檢測。（1）免疫熒光方法：用3.5%水合氯醛腹腔注射將大鼠麻醉，開胸暴露心臟，左心室插管，剪開右心耳，先快速灌入溫生理鹽水100mL至血液沖凈，隨后灌入4%多聚甲醛500mL固定。灌注固定后開顱取腦，4%甲醛浸泡，蔗糖梯度脫水，冰凍切片機切片，山羊血清封閉過夜，0.1%PBS洗滌后予以4℃條件下孵育熒光標記抗體過夜，再次洗滌后貼腦片、甘油封片，然后在熒光顯微鏡下觀察海馬Cx36的變化。（2）Western－blot方法：將大鼠急性斷頭，在冰上取出腦組織，秤取100mg海馬組織在1000μL蛋白裂解液加10μL蛋白酶抑制劑中勻漿，充分混勻后高速離心沉淀，取上清液，通過BCA法測出蛋白濃度。按每上樣孔60 μg蛋白上樣量計算出上樣容積，上樣至已制備好的10%分離膠板上樣孔里，以恒壓110V1.5h及恒流350mA 2h分別進行電泳及轉膜，然后牛奶封閉2h、一抗4℃孵育過夜、二抗室溫2h孵育、Ecl發光、暗房顯影定影，應用數字凝膠成像系統拍照，計算目的條帶與內參條帶灰度值比值，表示相對含量。

1.3統計學方法采用SPSS 11.5統計軟件進行統計學處理。數據結果以均數±標準差（s）表示，用藥前后行為學評分差異應用配對t檢驗，多個樣本均數比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義，組間兩兩比較用q檢驗。

2 結果

2.1各組大鼠Racine評分比較見表1，生理鹽水組大鼠給藥前后Racine評分差異無統計學意義（P＞0.05）。喹啉組及辛醇組大鼠給藥前后Racine評分差異有統計學意義（均P＜0.01）。與生理鹽水組比較，給藥后喹啉組及辛醇組Racine評分差異有統計學意義（均P＜0.01）。

表1 各組大鼠Racine評分比較 （s，分）

表1 各組大鼠Racine評分比較 （s，分）

注：與給藥前比較，＊P＜0.01；與生理鹽水組比較，△P＜0.01

組別 n 給藥前30min 給藥后30min 給藥后1h 給藥后2h 給藥后3h生理鹽水組 12 4.21±0.18 4.63±0.18 4.75±0.16 4.50±0.19 4.25±0.16喹啉組 12 4.32±0.25 1.13±0.14﹡△ 2.00±0.27﹡△ 0.88±0.12﹡△ 0.75±0.15﹡△辛醇組 12 4.29±0.27 1.25±0.23﹡△ 2.13±0.35﹡△ 1.00±0.15﹡△ 0.88±0.23﹡△

2.2各組大鼠海馬組織Cx36表達比較見表2。

2.2.1 應用免疫熒光法檢測大鼠海馬Cx36陽性細胞的表達：通過免疫熒光觀察發現各組均有Cx36陽性細胞的表達，生理鹽水組Cx36陽性細胞數明顯高于喹啉組及辛醇組，差異有統計學意義（P＜0.01）；而后2組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖1、圖2、圖3。

圖1 生理鹽水組海馬神經元C×36表達 A 10×10、B 10×20、C 10×40

圖2 喹啉組海馬神經元C×36表達 D 10×10、E 10×20、F 10×40

圖3 辛醇組海馬神經元C×36表達 G10×10、H10×20、I10×40

2.2.2 應用 Western－blot方法檢測大鼠海馬Cx36含量的變化：見圖4。通過 Western－blot方法檢測發現各組均有Cx36蛋白，生理鹽水組明顯高于喹啉組及辛醇組，差異有統計學意義（P＜0.01）；而后2組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖4 各組大鼠海馬神經元C×36表達變化 a：生理鹽水組，b：喹啉組，c：辛醇組

表2 各組大鼠海馬神經元Cx36表達比較（s）

表2 各組大鼠海馬神經元Cx36表達比較（s）

注：與生理鹽水組比較，＊P＜0.01

組別 n 陽性細胞數（個／mm2）灰度比生理鹽水組12 82.53±0.32 0.56±0.003喹啉組 12 27.34±0.18﹡ 0.21±0.004﹡辛醇組 12 26.24±0.29﹡ 0.24±0.005﹡

與生理鹽水組比較，喹啉組及辛醇組大鼠海馬Cx36表達水平顯著下降，差異有統計學意義（P＜0.01）；而后2組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

3 討論

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