小鼠心臟移植急性排斥反應模型的建立

劉琛 王斌 武多嬌 王春生

（復旦大學附屬中山醫院心外科，＊實驗研究中心，上海 200032）

心臟移植模型是器官移植實驗研究中最常用的模型，1973年Corry等[1]首次建立小鼠心臟移植模型。之后Matsuura等[2]成功將Cuff技術運用于小鼠頸部心臟移植模型，使手術難度大大降低。本研究借鑒Cuff技術，旨在建立BALB／c小鼠和C57BL／6小鼠頸部心臟移植模型，觀察移植心臟急性排斥反應，為今后的移植免疫研究奠定基礎。

1 資料與方法

1.1 實驗材料 選用8～10周齡BALB／c小鼠和C57BL／6小鼠，體質量約25 g，雄性，購自復旦大學實驗動物科學部。分兩組進行心臟移植試驗，每組各20對小鼠。實驗組的供受體分別為BALB／c小鼠和C57BL／6小鼠，對照組的供受體均為BALB／c小鼠。常規顯微手術器械購自上海醫療器械廠，10倍雙人雙目顯微手術放大鏡（上海醫用光學儀器廠SXP-1C型），9-0、10-0醫用無損傷血管縫線購自上海浦東金環醫療用品有限公司。

1.2 手術方法

1.2.1 受體的準備 用1%的戊巴比妥鈉（50mg／kg）麻醉受體小鼠后，將其固定于簡易手術臺。皮膚以安爾碘消毒后，采用右側頸部縱切口，上至下頜骨，下至鎖骨。切除下頜腺及部分胸鎖乳突肌，游離右側頸外靜脈，于頸淺靜脈分叉處結扎后，近心端用9-0縫線打活結暫時封閉血流，在近結扎端處切斷，用含50 U／mL肝素的0.9%氯化鈉溶液沖洗，安裝外徑0.8 mm、內徑0.5 mm的Cuff，用10-0的縫線固定。盡可能游離頸總動脈，于頸管內、外動脈分叉處結扎后，近心端用血管夾阻斷血流，于結扎點的近心端切斷，50 U／mL肝素0.9%氯化鈉溶液沖洗，安裝外徑0.6 mm、內徑0.4 mm的Cuff管，用10-0的縫線固定。

1.2.2 供體心臟的獲取與修整 供體小鼠用與受體小鼠相同的方法麻醉后固定于簡易手術臺。皮膚以安爾碘消毒后，正中切口開腹，顯露下腔靜脈，注入4℃含50 U／mL肝素的0.9%氯化鈉溶液1 mL后，沿雙側腋前線整塊切除胸前壁，將心臟連同胸腺組織和肺完整切取后，迅速置于4℃乳酸林格氏冰水混合物中。心臟完全停止跳動后，分離胸腺組織和食管；完全游離主動脈，在無名動脈水平予以橫斷；游離肺動脈至分叉處切斷；用9-0縫線結扎下腔靜脈、上腔靜脈及肺靜脈（盡量靠近心臟），并于遠心端切除肺組織。

1.2.3 移植手術 將修整好的供體心臟置于受體的手術切口內，表面覆蓋4℃0.9%氯化鈉液浸濕的紗布。先將供體心臟的主、肺動脈套于受體已裝好Cuff管的頸外靜脈，用10-0的縫線固定，再將供體心臟的主動脈套于受體已裝好Cuff管的頸總動脈，用10-0的縫線固定。先后開放頸外靜脈和頸總動脈的血流，同時用預熱的0.9%氯化鈉溶液迅速復溫。血管開放后，可見主動脈、肺動脈及冠狀動脈充盈，移植心臟顏色迅速由蒼白變為鮮紅，1 min左右心臟由纖顫轉為規律搏動。待移植的心臟復跳穩定后，將心尖朝向頭側擺正移植心位置，腹腔注射0.5 mL0.9%氯化鈉溶液，用5-0絲線連續縫合關閉切口。

1.3 觀察指標

1.3.1 手術成功的標準 以移植心臟成功復跳，連續搏動超過3 d為手術成功。

1.3.2 組織病理學分析 移植后第7天，在實驗組和對照組受體小鼠中隨機選取10只小鼠處死，取移植心臟標本，保存在10%多聚甲醛中。將心臟組織用石蠟包埋、切片（切片厚度為4～8μm）、脫水、固定，用蘇木精－伊紅染色，進行組織病理學分析。移植心臟排斥反應分級參照1990年國際心肺移植協會心臟移植急性排斥反應分級標準[3]。

1.3.3 移植心臟存活時間的觀察 對于手術成功的受體小鼠，肉眼觀察及直接觸摸移植心臟均無搏動時，判為急性排斥反應終點，統計移植心臟的存活期。

1.4 統計學處理 采用SPSS11.5統計軟件分析。數值變量以表示，兩組比較采用配對t檢驗。所有統計學計算均采用雙側檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 手術成功率 術后移植心臟復跳率達100%，實驗組1只小鼠術后未蘇醒，可能與術中失血過多有關。對照組1只小鼠蘇醒后出血過多而死亡，另1只小鼠術后第2天移植心臟停跳。手術成功率達92.5%（37／40）。

2.2 術后第7天移植心臟組織病理學結果 實驗組移植心臟可見心肌細胞間質有大量淋巴、巨噬細胞浸潤，并有心肌水腫、溶解、壞死，急性排斥反應等級為3.55±0.44；對照組移植心臟僅見間質少量淋巴細胞浸潤，無壞死改變，急性排斥反應等級為0.40±0.32；兩組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。兩組移植心臟組織的病理圖片見圖1。

圖1 實驗組和對照組移植心臟的心肌組織病理學檢查（HE，×200）

2.3 兩組移植心臟存活時間比較 實驗組剩余的9只小鼠移植心臟存活（8.22±0.67）d，對照組剩余的8只小鼠移植心臟存活＞100 d（見圖2），兩組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖2 兩組移植心臟存活時間比較

3 討 論

小鼠頸部心臟移植較腹部心臟移植，操作簡便、手術時間短；對小鼠的生理狀況影響小，小鼠術后存活率高，且便于觀察移植心臟搏動情況。但小鼠頸部心臟移植對術者的吻合技術以及對設備要求較高，且易出現吻合口出血及血栓形成。將Cuff技術運用于小鼠頸部心臟移植，手術難度大大降低，且出血明顯減少，易于保證術后吻合口的通暢。

BALB／c和C57BL／6小鼠是純系的同種小鼠，具有不同的主要組織相容性抗原（MHC-Ⅰ、Ⅱ），可應用于同種排斥反應的免疫學研究。BALB／c小鼠以 Th2型為主，C57BL／6 小鼠以 Th1型為主[4]。同種移植急性排斥反應主要由Th1介導[5]。小鼠心臟移植急性排斥反應模型的供受體分別為BALB／c和 C57BL／6[6]。

本研究中，我們對Cuff套管法稍作改進，先進行受體準備，再獲取供體心臟，控制供體心臟的缺血時間在30 min以內；血管開放后，移植心臟顏色迅速由蒼白變為鮮紅，1 min之內移植心臟即可復跳，復跳率100%。由于頸外靜脈較短，且分支較多，我們創新性地對其用9-0縫線活結阻斷，而未使用血管夾，增大了手術操作范圍，提高了成功率。受體的動靜脈套管完成后，分別將其套入供體心臟的主動脈和肺動脈，第一個結打于結扎線遠端，以防止血栓形成，第二個結打于結扎線近端，以防止結扎線脫落。

本研究中，實驗組與對照組相比，術后8 d左右移植心臟停跳，心肌組織的病理學表現為大量淋巴細胞浸潤、心肌細胞水腫或壞死，說明小鼠心臟移植急性排斥反應體外模型已成功建立。該模型操作簡單，無需深厚的顯微外科功底，且重復性好，手術成功率高，值得推廣。

[1]Corry RJ，Winn HJ，Russell PS.Primarily vascularized allografts of hearts in mice.The role of H-2D，H-2K，and non-H-2 antigens in rejection [J].Transplantation，1973，16（4）：343-350.

[2]Matsuura A，Abe T，Yasuura K.Simplified mouse cervical heart transplantation using a cuff technique[J].Transplantation，1991，51（4）：896-898.

[3]Billingham ME，Cary NR，Hammond ME，et al.A working formulation for the standardization of nomenclature in the diagnosis of heart and lung rejection：Heart Rejection Study Group.The International Society for Heart Transplantation[J].Heart Transplant，1990，9（6）：587-593.

[4]Wang H，Hosiawa KA，Min W，et al.Cytokines regulate the pattern of rejection and susceptibility to cyclosporine therapy in different mouse recipient strains after cardiac allografting[J].J Immunol，2003，171（7）：3823-3836.

[5]van Besouw NM，Daane CR，Vaessen LM，et al.Different patterns in donor-specific production of T-helper 1 and2 cytokines by cells infiltrating the rejecting cardiac allograft[J].J Heart Lung Transplant，1995，14（5）：816-823.

[6]Shariff H，Greenlaw RE，Meader L，et al.Role of the Fc region in CD70-specific antibody effects on cardiac transplant survival[J].Transplantation，2011，92（11）：1194-1201.