RNA干擾HIF-2α基因對人肺腺癌A549細胞株侵襲轉移的影響

袁凱 王勇 童繼春 袁衛東 陳棟

（南京醫科大學附屬常州第二人民醫院胸心外科，江蘇 常州 213003）

缺氧微環境在肺癌發生發展中起著重要作用，缺氧誘導因子（hypoxia-inducible factors，HIFs）是缺氧微環境中的關鍵分子[1]。研究認為，HIFs的功能主要是由α亞基決定的[2]。HIF-1α和 HIF-2α是其中兩種亞型，兩者雖然結構相似但功能存在差異。我們先前的研究顯示，HIF-1α和 HIF-2α在非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）組織中廣泛表達，其中 HIF-2α表達與腫瘤大小、TNM分期以及患者預后關系密切，相反HIF-1α則無明顯相關[3－4]。在另 一項研 究中，我 們對人肺 腺癌A549細胞株成功進行了缺氧培養，并在多個缺氧時點進行了 HIF－α的檢測。結果顯示，HIF-1α對于急性缺氧環境極為敏感，其表達在4 h即至高峰，而HIF-2α在慢性缺氧環境有持續較強表達[5]。通過該項研究我們認識到，HIF-1α和 HIF-2α在缺氧過程調節中可能各有側重，即HIF-1α是急性缺氧期的主要反應因子，而HIF-2α則主導慢性缺氧調節。NSCLC等實體腫瘤所在的慢性缺氧環境中，HIF-2α可能發揮更大的作用。本研究利用小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）技術抑制人肺腺癌細胞株A549中HIF-2α基因的表達，觀察A549侵襲轉移能力的變化，進一步探討 HIF-2α在NSCLC中的生物作用機制。

1 資料與方法

1.1 材料 A549細胞株購自中科院上海細胞生物學研究所，pGPU6／GFP／Neo質粒購于上海GeneP-harma制藥技術有限公司，實驗所需各種酶購自Takara公司，鼠抗人HIF-2α單克隆抗體購自Abcam公司，Lipofectamin 2000購自Invitrogen公司，Transwells小室購自美國Corning公司，Matrigel基質膠購自美國BD Biosciences公司。

1.2 主要儀器 CY-12C便攜式氧濃度監測儀（建德市梅城電化分析儀器廠）；CO2培養箱（美國Thermo公司）；Esco垂直流／水平流超凈工作臺（新加坡Esco公司）；5415D小型高速離心機、5702R臺式冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；Roto-Gene 3000熒光定量PCR儀（澳大利亞Corbett Research公司）；臺式超聲細胞破碎儀（英國SANYO公司）；酶標儀、電泳儀及電轉儀（美國Bio-Rad公司）；KHY100空氣恒溫搖床（上海蘇豪智能系統有限公司）；IX51倒置顯微鏡、BX51熒光顯微鏡（日本OLYMPUS公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養及分組 A549細胞在DMEM培養基中常規培養傳代。實驗分組：空白對照組（僅用轉染試劑處理），陰性對照組（轉染siRNA陰性質粒），HIF-2α-siRNA 組 （轉 染 HIF-2α-siRNA 質粒）。每組設3復孔。各實驗組細胞瞬時轉染24 h后鋪板并缺氧培養1～2 d。

1.3.2 靶向抑制HIF-2α的siRNA的設計與合成參考siRNA設計原則[6]，設計4條針對 HIF-2α的siRNA，另設計1條無關序列作為陰性對照。對于每條選定的siRNA序列，設計2條編碼該序列的單鏈寡核苷酸（single-strand oligonucleotide，ss oligo）模板，并交由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.3.3 siRNA表達載體的構建 將合成的ss oligo退火，與經過Bbs I、BamH I雙酶切的質粒pGPU6／GFP／Neo連接，熱轉化至大腸桿菌JM109中，37℃過夜培養，堿裂解法快速抽提質粒。

1.3.4 細胞轉染 胰酶消化培養A549細胞并鋪板。轉染前將質粒DNA及10μL脂質體分別加入250μL無血清DMEM培養基中并輕輕混勻，靜置混合。然后將上述混合液加入1.5 mL無血清培養基中，混勻后將其加入漂洗過的細胞中，輕柔晃動平板使之與細胞充分接觸。37℃下培養6 h后將其中的培養基吸出棄去，更換新鮮培養基并置于缺氧環境下繼續培養24、48 h。

1.3.5 轉染效果檢測 pGPU6／GFP／Neo載體可表達GFP綠色熒光蛋白，轉染后24 h和48 h分別在熒光顯微鏡下觀察5個視野，計數100個細胞，計算轉染效率。

1.3.6 qRT-PCR 按常規方法提取樣品總RNA，進行實時定量 PCR 檢測。HIF-2α 正義鏈：5′-GAAAACGAGTCCGAAGCC-3′； 反 義 鏈：5′-CCCAAAACCAGAGCCATT-3′。β-actin 正 義 鏈：5′-CTCTTCCAGCCTTCCTTCCTG-3′；反義鏈：5′-CAGCACTGTGTTGGCGTACAG-3′。擴 增 反 應條件為95℃90 s；95℃5 s，58℃30 s，共40個循環，計算采用2-ΔΔCT法。實驗重復3次。

1.3.7 Western-blot及酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測蛋白表達 按常規方法進行。

1.3.8 Transwell檢測法 取100μL Matrigel稀釋后鋪于Transwell小室，4℃風干。胰酶消化貼壁細胞，重懸細胞并調整至密度為1×105個／mL。取200μL細胞懸液加入Transwell小室，在下室內加入含胎牛血清的完全培養基，分別缺氧培養24 h和48 h。培養結束后，取出小室并洗膜，將濾膜用甲醛固定并染色。鏡下計數上、下、左、右、中5個隨機視野細胞數，取均值。

1.4 統計學處理 采用SPSS 13.0統計軟件進行數據處理。計量資料以均數±標準差（）表示。對于多組數據比較，采用單因素方差分析（ANOVA）檢驗。組間兩兩比較時，用Levene法進行方差齊性檢驗。若方差齊，采用LSD檢驗；若方差不齊，則用Games-Howell法進行分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 轉染 HIF-2α-siRNA 后 HIF-2αmRNA 表達水平的變化 各組細胞HIF-2αmRNA的表達水平見表1。單因素方差分析顯示，各組間HIF-2αmRNA表達水平存在顯著差異（轉染后24 h：F＝26.13，P＜0.01；轉染后 48 h：F＝46.32，P＜0.01）。與空白對照組相比，轉染后缺氧培養24 h和48 h，HIF-2α-siRNA 組 HIF-2αmRNA 表達水平均下降。在轉染后24 h，4條 HIF-2α-siRNA對HIF-2αmRNA的抑制率差異有統計學意義（P＜0.01）。在 HIF-2α-siRNA 各組間兩兩比較顯示，HIF-2α-siRNA-4組在轉染后兩個時點HIF-2α mRNA表達水平低于其他3組（P＜0.01）。陰性對照組HIF-2αmRNA雖略有下降，但與空白對照組間差異無統計學意義（P＞0.05）。

表1 A549細胞中 HIF-2α-siRNA對 HIF-2αmRNA表達的抑制作用

2.2 轉染 HIF-2α-siRNA后 HIF-2α蛋白表達水平的變化 Western blot法檢測HIF-2α蛋白表達，結果見表2及圖1。單因素方差分析顯示，各組蛋白表達差異有統計學意義（轉染后24 h：F＝16.80，P＜0.01；轉染后48 h：F＝223.69，P＜0.01）。組間兩兩比較顯示，與空白對照組相比，HIF-2α-siRNA-1組在兩個時點蛋白表達均無顯著改變（P＞0.05）；HIF-2α-siRNA-2組在轉染后48h與空白對照組相比，蛋白表達下調（P＜0.01）；HIF-2α-siRNA-3、4組細胞在轉染后兩個時點與空白對照組的HIF-2α蛋白表達水平相比均有顯著下調（P＜0.01），而 HIF-2αsiRNA-4相較于 HIF-2α-siRNA-3組，在轉染后48 h其HIF-2α蛋白水平更低（P＜0.01）。陰性對照組與空白對照組相比，在兩個時點其HIF-2α蛋白表達差異無統計學意義（P＞0.05）。轉染 HIF-2α-siRNA-4重組質粒的A549細胞中HIF-2α蛋白下調最為顯著，且在轉染后48h抑制效果最好。

表2 A549細胞中HIF-2α-siRNA對HIF-2α蛋白表達的抑制作用

圖1 各組細胞中HIF-2α蛋白的Western blot分析

2.3 HIF-2α-siRNA對 A549細胞侵襲轉移的影響Transwell小室法結果如表3及圖2所示。方差分析顯示，各組穿膜細胞數存在顯著差異（24 h：F＝2471.37，P＜0.01；48 h：F＝191.24，P＜0.01）。兩兩比較顯示，與空白對照組相比，實驗組在缺氧培養兩個時點其穿膜細胞數均顯著下降，差異有統計學意義（P＜0.01）。陰性對照組與空白對照組相比，穿膜細胞數差異無統計學意義（P＞0.05）。

表3 各組的穿膜細胞數

圖2 Transwell法測定各組細胞的侵襲力

2.4 ELISA法檢測各組細胞VEGF表達水平 本研究采用ELISA法檢測各組細胞在缺氧培養24 h和48 h后血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）蛋白的表達水平，結果如表4所示。方差分析顯示，各組間VEGF蛋白表達水平有顯著差異（24 h：F＝26.37，P＜0.01；48 h：F＝203.30，P＜0.01）。兩兩比較顯示，與空白對照組相比，HIF-2α-siRNA組VEGF蛋白水平在轉染后兩個時點均顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.01）。空白對照組與陰性對照組之間VEGF蛋白表達水平差異無統計學意義（P＞0.05）。

表4 各組VEGF蛋白的表達情況

3 討 論

RNA干擾（RNA interference，RNAi）是一種進化過程中高度保守的抵御外來基因或病毒侵犯的防御機制。siRNA是RNA干擾作用賴以發生的重要中間效應分子。siRNA是一類長21～25個核苷酸的特殊dsRNA分子，siRNA的序列與所作用的靶mRNA序列具有同源性；siRNA兩條單鏈末端為5′端磷酸和3′端羥基；每條單鏈的3′端均有2～3個突出的非配對的堿基。研究表明，RNAi的作用機制包括起始階段、效應階段及反應擴大階段。RNAi作為基因阻斷技術，具有特異性強、高效性的優點。用RNAi技術來抑制目標基因的異常表達，為治療癌癥、遺傳病等疾病開辟了新的途徑。

本研究構建了4條針對HIF-2α的siRNA序列發現 HIF-2α-siRNA-4對 HIF-2α的抑制效果最為明顯，在轉染后24 h和48 h HIF-2αmRNA表達相較于空白組下調了（60.63±5.10）%和（80.00±3.55）%；相應在蛋白水平分別下調了（31.69±11.56）%和（82.87±4.09）%。Transwell試驗結果發現，HIF-2αsiRNA組穿膜細胞數顯著少于兩對照組（P＜0.01），提示HIF-2α與A549細胞侵襲力有密切關系。

目前，關于HIF-1α和VEGF的關系研究較多且較深入，而對HIF-2α與VEGF的關系則研究較少。在 Wu等[3]的研究中，發現 VEGF的表達與 HIF-2α的蛋白表達密切相關。本研究采用siRNA技術抑制HIF-2α表達后，同樣觀察到在轉染后24h和48h，VEGF表達較對照組顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.01）。綜上所述，HIF-2α有望作為靶點應用于NSCLC的治療。

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[3]Wu X H，Qian C，Yuan K.Correlations of hypoxia-inducible factor-1alpha／hypoxia-inducible factor-2alpha expression with angiogenesis factors expression and prognosis in non-small cell lung cancer[J].Chin Med J（Engl），2011，124（1）：11-18.

[4]袁凱，鄭如恒.HIF-2α與人非小細胞肺癌增殖及預后的關系[J].中國臨床醫學，2009，16（2）：194-197.

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