還原型谷胱甘肽對大鼠急性肺損傷的保護作用

劉振威 李玉霞 方閱a 高風英

（1.上海交通大學附屬第一人民醫院呼吸科，a藥劑科，上海 200080；2.上海市建工醫院呼吸科，上海 200083）

失血性休克時發生的急性肺損傷（acute lung injury，ALI）嚴重時可發展為急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS），威脅患者的生命。目前，還原型谷胱甘肽已被廣泛用應于心肌梗死、腦缺血和急性腦損傷等的治療[1]。但是，還原型谷胱甘肽對ALI是否具有保護作用，尚鮮見相關文獻報道。本研究通過建立失血性休克的大鼠模型，造成ALI，復蘇時應用還原型谷胱甘肽，然后檢測大鼠動脈血漿中腫瘤壞死因子－α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和肺組織中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）含量以及支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中肺泡巨噬細胞（pulmonary alveolar macrophages，PAM）、中 性 粒 細 胞 （polymorphonuclear leukocytes，PMN）總數和蛋白質含量，并觀察肺組織含水率、組織形態學等指標的變化，探討還原型谷胱甘肽對ALI的保護作用。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 取健康SD大鼠（復旦大學上海醫學院動物中心）24只，體質量（276.5±1.5）g，雌雄各半。

1.2 試劑與藥品 TNF-α測定試劑盒（中國人民解放軍第四軍醫大學免疫學教研室，批號20110113）；SOD測定試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號20110108）；還原型谷胱甘肽（北京協和藥廠，批號20040223，每支600 mg）。

1.3 儀器 AXSYM全自動酶免分析儀（美國雅培公司）；AU640全自動生化分析儀（日本奧林帕斯公司）；SF23000全自動血球計數儀（日本東亞公司）；ML780型MacLab生理記錄儀（澳大利亞ADI公司）；DX51光學顯微鏡（日本奧林帕斯公司）；H27500透射電鏡（日本東芝株式會社）。

1.4 研究方法

1.4.1 失血性休克SD大鼠模型的建立 按照Wiggers改良法建立失血性休克模型[2]。通過三通接頭連接生理記錄儀，記錄平均動脈壓（MAP）和心率（HR）。

1.4.2 實驗分組 將24只大鼠隨機分為假手術組、模型對照組和研究組，每組8只，試驗前12 h禁食、禁飲。失血性休克后復蘇時，模型對照組靜脈滴注0.9%氯化鈉液，1.5 mL／kg；研究組靜脈滴注還原型谷胱甘肽，40 mg／kg；假手術組只進行手術操作，不建立休克模型，并靜脈滴注0.9%氯化鈉液，1.5 mL／kg。

1.5 觀察指標

1.5.1 TNF-α含量 于大鼠休克前、休克90 min、復蘇1 h末、復蘇3h末，分別經股動脈取血1 mL，離心后分離血漿，－70℃保存，按照TNF-α測定試劑盒說明書操作。

1.5.2 BALF中PAM、PMN和蛋白含量 實驗結束即刻，迅速剖胸取左肺，用0～4℃0.9%氯化鈉液8 mL灌洗支氣管和肺，灌洗5次，并收集灌洗液。甲紫染色后計數BALF中吞噬細胞總數；用瑞氏液染色計數PAM和PMN，計算百分率，將百分率乘以細胞總數即得到細胞的絕對數。將BALF以1500 r／min離心5 min，取上清液用考馬斯亮蘭法測定其中蛋白含量。

1.5.3 SOD含量 取肺組織勻漿，按試劑盒說明書操作。

1.5.4 肺組織含水率 含水率＝（濕質量－干質量）／濕質量×100%，計算肺組織的含水率。

1.5.5 形態學觀察 在光鏡下觀察肺組織形態學變化。

1.6 統計學處理 采用SPSS 10.0軟件包進行統計學分析。全部數據采用均數±標準差（）表示，組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 血漿TNF-α含量的變化 休克前3組大鼠TNF-α含量見表1。

2.2 BALF中細胞數量、蛋白含量的變化 見表2。

表1 3組血漿TNF－α含量比較（ng／L）

表2 3組BALF中細胞數量和蛋白含量比較

2.3 肺組織SOD含量、含水率的比較 見表3。

表3 3組復蘇后肺組織SOD含量和含水率比較（，n＝8）

表3 3組復蘇后肺組織SOD含量和含水率比較（，n＝8）

注：與假手術組比較，aP＜0.01；與模型對照組比較，b P＜0.01

組別 n SOD含量（nU／mg） 含水率（%）假手術組 8 7.37±0.38 70.23±1.90模型對照組 8 4.01±0.34a 79.45±0.99a研究組 8 6.35±0.12b 75.09±0.96b

2.4 肺組織形態學觀察 光鏡下可見假手術組肺組織的肺泡壁薄，相鄰肺泡僅隔以薄層間質；模型對照組肺組織間質增厚，粒細胞浸潤，部分區域呈肺不張狀態；研究組肺組織間質增厚以及粒細胞浸潤的程度顯著輕于模型對照組。

3 討 論

Bhetia等[2]研究證實，體內 TNF－α水平的升高是失血性休克導致ALI的重要因素，而且其升高程度與ARDS的發生有一定的相關性。本研究顯示，SD大鼠失血性休克后血漿TNF－α含量持續升高，以復蘇后3 h最為明顯；應用還原型谷胱甘肽后，血漿TNF-α升高幅度降低，提示還原型谷胱甘肽在一定程度上抑制了TNF－α的合成或釋放，進而對肺損傷起到保護作用。本研究中假手術組的TNF－α含量也出現小幅度上升，可能因手術操作使局部組織損傷所致。Bhatia等[2]研究認為，PMN在肺泡腔的大量積聚是ALI的特征性變化，檢測BALF中的PMN數量可以直接反映PMN浸潤的程度。肺毛細血管通透性增高是肺損傷后的基本病理改變，表現為血管中水和蛋白漏出血管壁，故測定BALF中的蛋白含量以及肺組織含水量可在一定程度上反映肺血管內皮細胞的損傷。本研究發現，復蘇后模型對照組、研究組肺組織BALF中PMN的數量、蛋白含量、含水率高于假手術組，表明失血性休克導致了肺水腫等ALI的表現，這與光鏡下觀察到的肺間質增寬、粒細胞浸潤等組織學變化相符；還原型谷胱甘肽能夠顯著改善肺水腫。SOD可以清除氧自由基，保護細胞免受損傷。應用氧自由基清除劑可以降低多器官功能衰竭的發生率[3－4]。測定SOD活力可反映組織抗氧化能力。本研究中，模型對照組肺組織中SOD活力較假手術組低，提示肺損傷過程中自由基清除不足，故組織細胞損傷較重。

綜上所述，還原型谷胱甘肽因能夠抑制ALI時血漿TNF-α含量的升高，減輕PMN浸潤，清除氧自由基，減輕肺組織水腫程度，從而對ALI起到有效的保護作用。

[1]Wu J，Ferrance JP，Landers JP，et al.Integration of a preco lumn fluorogenic reaction，separation，and detection of reduced glutathione[J].Anal Chem，2010，82（17）：7267-7273.

[2]Bhatia M，Zemans RL，Jeyaseelan S，et al.Role of chemokines in the pathogenesis of acute lung injury[J].Am J Respir Cell Mol Biol，2012，46（5）：566-572.

[3]Alastair G，Proudfoot，Danny F，et al.Human models of acute lung injury[J].Dis Model Mech，2011，4（2）：145-153.

[4]Perl M，Lomas-Neira J，Venet F，et al.Pathogenesis of indirect（secondary）acute lung injury[J].Expert Rev Respir Med，2011，5（1）：115-126.