電紡納米銀/碳納米纖維敷料的制備及抗菌效果評價

徐亞飛，關宏宇，楊姍姍，牛震海，榮蘭香，于家傲

(1.吉林大學第一醫院二部燒傷外科，吉林 長春 130031；2.東北師范大學化學學院，吉林 長春 130024)

燒傷創面敷料為創面愈合提供最佳的微環境，對于創面愈合起著至關重要的作用。雖然許多傷口敷料已應用于臨床實踐中，但很少有傷口敷料可以充分滿足創面愈合的多項要求。對于良好的燒傷敷料來說，如何防止創面感染、促進創面愈合是其需要解決的關鍵問題。靜電紡絲技術(以下稱電紡)制備的納米纖維支架具有與天然細胞外基質(ECM)相似的形態特點：連續超細纖維、高表面體積比、高孔隙率和可變孔徑分布[1]，經實驗證實其可以刺激細胞合成多種細胞因子和生長因子，促進細胞生長及創面愈合[2]。但單純的電紡纖維難以具有較好的抑菌能力。選擇適當的抗菌藥物，與電紡纖維敷料結合可能制造出較理想的燒傷創面敷料。在抗菌藥物的選擇上，納米銀因其具有較好的抑菌能力，且其耐藥性、安全性及過敏性等較好，現已被應用于多種藥物及創面敷料中[3-5]。本研究采用聚丙烯腈(polyacrylonitrile,PAN)為前軀體高分子，利用電紡技術及銀鏡反應制備納米銀/碳納米纖維復合敷料(以下稱復合纖維敷料)，觀察其體外抑菌能力，旨在進一步探索理想燒傷創面敷料的研制。

1 材料與方法

1.1 碳纖維的制備過程

1.1.1 PAN納米纖維的制備 首先稱取3 g的PAN粉末(Mw=100 000)，在磁力攪拌情況下，緩慢加入到N,N-二甲基甲酰胺(DMF)20 mL中，經過大約6 h的攪拌，直至溶液變成澄清透明的溶液。將配制好的紡絲溶液轉移到1個帶有12號不銹鋼針頭的20 mL注射器中，1張20 cm×20 cm薄的鋁箔紙平鋪于一段接地的金屬導電板上，不銹鋼針頭與高壓靜電電源 (ES30P-5W,大連高電壓研究有限公司) 相連接，電源可以產生0～60 RV的直流高壓電。在實驗過程中，使用15 kV作為紡絲電壓，針頭和接收板的距離大約15 cm。整個電紡過程在室溫條件下操作，纖維絲落到旋轉的接收鼓上。見圖1。

1.1.2 碳納米纖維的制備 將制備好的PAN納米纖維放入管式爐中，經過預氧化、高溫熱裂解，PAN纖維發生中溫碳化和900℃以上的高溫碳化，形成網狀碳纖維結構。在預氧化過程中，室溫以1℃·min-1的速率升到270°C，然后保持2 h。PAN納米纖維的預氧化過程中腈基聚合形成網結構，這種結構就是熱穩定性好的梯形結構，使其在碳化過程中不會熔融。預氧化結束后，進行高溫熱裂解，在高純氮氣的保護下，從預氧化的最終溫度270°C，以5℃·min-1的速率升至900℃，然后在氮氣保護下，自然冷卻到室溫。

圖1 納米PAN纖維電紡示意圖

1.1.3 碳纖維負載納米銀 將制備的碳納米纖維轉移到0.1 mol·L-1Ag(NH3)220 mL+0.4 mol·L-1CH3CHO 1 mL的銀鏡反應溶液中，在環境溫度下，放置24 h后得到復合纖維敷料。

1.2 復合纖維敷料抗菌性實驗

1.2.1 標準菌群及主要試劑 金黃色葡萄球菌(ATCC 25923)、大腸埃希菌(ATCC 25922)、銅綠假單胞菌(ATCC 27853)；營養瓊脂培養，水解酪蛋白瓊脂培養基，磷酸緩沖液(PBS，0.03 mol·L-1，pH 7.2)。以上材料均由吉林大學第一醫院二部微生物實驗室提供。

1.2.2 實驗分組 ①復合纖維敷料組；②納米碳纖維敷料組；③標準慶大霉素紙片組，由吉林大學第一醫院二部微生物實驗室提供；④優拓(urgotul，SSD)組，Laboratoires Urgo公司生產的燒傷、感染傷口的專用敷料。

1.2.3 實驗菌株培養 復蘇實驗室凍干標準菌株金黃色葡萄球菌 (ATCC 25923)、大腸埃希菌(ATCC 25922)及銅綠假單胞菌(ATCC 27853)，接種于普通瓊脂培養基平板，37℃培養24 h備用。

1.2.4 抑菌環實驗法 將制備好的納米碳纖維、復合纖維敷料、慶大霉素及優拓抑菌紙片剪裁成直徑6 mm大小的圓片，每組9個，采用K-B紙片擴散法進行檢測，細菌濃度0.5麥氏單位。檢測中使用肉湯培養基，因為此種培養基及pH值固定，瓊脂板厚度4 mm，可確保相同菌群檢測的可重復性。

1.2.5 觀察指標 抑菌環直徑>7 mm為有抑菌作用，抑菌環直徑≤7 mm時，為無抑菌作用。3次重復實驗均有抑菌作用結果為合格。

1.3 統計學分析

2 結 果

2.1 樣品的形貌表征

經掃描電鏡觀察：制備的純碳納米纖維的直徑約為200 nm，纖維比較直，纖維之間分立的比較好，表面比較光滑(圖2A)。通過室溫下的銀鏡反應，纖維的直徑有些變粗，約230 nm，并且纖維表面變得粗糙。EDX能譜分析顯示：碳纖維的表面覆蓋了一層銀納米顆粒(圖2B)。

圖2 碳納米纖維(A)和銀修飾的碳納米纖維(B)

2.2 抑菌實驗

實驗通過K-B紙片擴散法證實：①復合纖維敷料和優拓對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和大腸埃希菌標準菌株均有較好的抑菌效果，但低于標準抗菌藥物慶大霉素藥敏紙片組(其抑菌環直徑均>7 mm)，同慶大霉素標準紙片組比較差異有統計學意義(P<0.05)。②復合纖維敷料對于金黃色葡萄球菌及銅綠假單胞菌抑菌效果優于優拓，復合纖維敷料對2種細菌抑菌環直徑平均值分別為14.12和15.64 mm，優拓抑菌環直徑分別為8.36和8.45 mm，組間比較差異有統計學意義(P<0.05)；但其對大腸桿菌的抑制效果低于優拓，復合纖維敷料對大腸桿菌抑菌環直徑平均值為9.11 mm，優拓抑菌環直徑為12.27 mm，組間比較差異有統計學意義(P<0.05)。③碳納米纖維組在此實驗中未顯示出具有抑菌能力(其抑菌環直徑均<7 mm)。見圖3(插頁三)和表1。

3 討 論

ECM的重要特點是由納米級大小的纖維蛋白構成的纖維多孔網狀結構，其對于誘導細胞的正常行為及器官的生長發育十分重要[6]。由于電紡制備的納米纖維網狀結構與天然ECM網狀結構相似，并且其高比表面積和高孔隙率能夠更加有利于創面的正常代謝，能提供近似的細胞生長微環境，從而使創面敷料具有良好的促進皮膚細胞生長及創面愈合的作用。碳纖維敷料因其具有良好的吸水性，無細胞毒性、無刺激、無致敏及抗炎的特點逐漸應用于燒傷創面[7]。相關實驗[8]證實：碳納米纖維具有較好的組織相容性。納米銀具有較好的抑菌效果，且在耐藥性、安全性、過敏性等方面優于傳統的磺胺嘧啶銀[9]。納米銀敷料比磺胺嘧啶銀缺少了磺胺嘧啶的協同作用，其理化性質發生了很大改變，由于納米銀的顆粒非常小，所以使用與磺胺嘧啶銀同等量銀時，其顆粒接觸面擴大，殺菌作用明顯增強[9]。納米銀的抗菌機理尚未完全明確，現在研究多認為：一方面銀離子破壞細胞膜，造成細胞內液外漏殺傷細菌[10]；另一方面通過影響細菌體內的DNA復制使細菌繁殖受到抑制[11]。另外，Shin等[12]研究顯示：濃度為1～5 ppm的納米銀有利于外周血單核細胞的貼壁與增殖。

表1 各組的抑菌實驗結果

電紡技術在噴頭及接收板之間形成強大電場，這樣不斷噴出的纖維絲因其帶電荷分子的不同，造成纖維絲不確定擺動，自發形成層層交疊的纖維膜。在制備過程中纖維直徑可通過改變電場電壓進行控制。本實驗通過電紡技術制備出大小為200～300 nm的PAN纖維，通過電紡本身層層交疊的特點，形成納米級支架結構。經過高溫碳化后，在不破壞其納米結構的基礎上形成具有較好組織相容性的納米碳纖維，使敷料具有模擬ECM促進創面愈合的能力。通過銀鏡反應使納米銀負載于碳纖維后，制備出的復合纖維敷料經體外抑菌實驗證實：其對銅金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及綠假單胞菌均有較好抑制能力，但碳纖維本身不具有抗菌能力，說明復合纖維敷料的抑菌能力為負載的納米銀所致；本實驗結果顯示：復合纖維敷料對銅綠假單胞菌及金黃色葡萄球菌的抑制效果優于大腸桿菌，這也與陳美婉等[13]的研究結果相似。同時實驗中復合纖維敷料與優拓進行對比研究顯示：納米銀對大腸桿菌的抑制效果較差，這可能與磺胺藥物對大腸桿菌具有較好的抑制作用有關。

本實驗中復合纖維敷料的優點：①納米級纖維支架結構使敷料具有模擬ECM促進創面愈合的能力；②對銅金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及綠假單胞菌均具有較好的抑制效果；③因為納米纖維層層交疊后，敷料空洞明顯小于細菌直徑，可起到有效隔離外界細菌污染的作用。其缺點：①纖維材料較脆，難以良好地貼合創面；②材料制備復雜，難以大量生產。未來實驗需要解決的問題：①本次抑菌實驗時間較短，碳/納米銀纖維是否在較長時間內(期望為1周)均具有較好的抑菌效能，尚需大樣本長時間的實驗研究；②燒傷創面每次換藥都會伴隨著劇烈的疼痛，碳/納米銀纖維在創面應用中是否具有較好不粘性尚待驗證。

綜上所述，本研究構建的復合纖維敷料具有類似于ECM的納米級多孔網狀結構，并有較好的抑菌能力，該材料的制備為理想燒傷創面敷料的研究提供了新的思路。

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