NS-398對(duì)人胃癌細(xì)胞系SGC-7901增殖、凋亡和COX-2表達(dá)的影響

余 濤，李良慶，王家興，于錫陽，栗大偉

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院胃腸外科一區(qū)，福建福州350004)

胃癌是世界上最常見的消化道惡性腫瘤之一，尤其是在東亞和東南亞，包括中國在內(nèi)［1］。每年我國因胃癌死亡的人數(shù)占各種惡性腫瘤之首，傳統(tǒng)手術(shù)及術(shù)后化療對(duì)進(jìn)展期胃癌的治療仍不理想，近年來，隨著對(duì)腫瘤分子生物學(xué)研究的不斷深入，針對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期等的研究逐漸成為抗腫瘤治療的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。環(huán)氧合酶－2(cyclooxygenase-2，COX-2)作為新型腫瘤標(biāo)志物，在多種人類腫瘤中過度表達(dá)，在腫瘤的進(jìn)展中，COX-2參與了許多病理生理過程，包括細(xì)胞的增殖、凋亡、調(diào)節(jié)免疫和血管生成［2－3］。近年來選擇性COX-2抑制劑，在抗腫瘤通路中受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，本實(shí)驗(yàn)通過MTT、免疫組化、ELISA、流式細(xì)胞儀觀察選擇性COX-2抑制劑NS-398在體外對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響。

1 材料和方法

1.1 主要材料及試劑 人胃癌SGC-7901細(xì)胞株購自南京凱基生物技術(shù)有限公司。NS-398購自美國Sigma公司;四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)購自美國Sigma公司;胰蛋白酶、RMPI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司;前列腺素－E2(prostaglandin E2，PGE2)酶聯(lián)免疫測定試劑購自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所;Alexa Fluor 488Annxin V/PI試劑盒購自Invitrogen公司。COX-2免疫組織化學(xué)試劑盒購自北京中杉金橋生物公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) SGC-7901細(xì)胞置于37℃，體積分?jǐn)?shù)5%CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)液為含體積分?jǐn)?shù)10%滅活胎牛血清的RMPI-1640培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞呈對(duì)數(shù)增殖并覆蓋培養(yǎng)瓶瓶底80%面積時(shí)可用于傳代或?qū)嶒?yàn)。

1.2.2 MTT法測定NS-398對(duì)SGC-7901細(xì)胞的抑制率 取對(duì)數(shù)期生長的SGC-7901細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，以每孔1.0×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔板培養(yǎng)24 h后。換 NS-398 濃度分別為 50、100、200 μmol·L－1的含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RMPI-1640培養(yǎng)基，其中設(shè)空白對(duì)照組，即未加藥的培養(yǎng)基，每種濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng) 24、48、72 h后，再向每孔加 MTT(5 g·L－1)20 μL，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，吸去原培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩 10 min;用酶標(biāo)儀(波長 490 nm)測定每個(gè)孔的吸光度(OD)值，按下列公式計(jì)算細(xì)胞抑制率，抑制率=(1－實(shí)驗(yàn)組OD值)/對(duì)照組OD值×100%。

1.2.3 免疫組化方法檢測COX-2蛋白的表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長期的SGC-7901細(xì)胞接種于含蓋玻片的6孔板內(nèi)，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，換NS-398濃度分別為50、100、200 μmol·L－1的含體積分?jǐn)?shù) 10%胎牛血清 RMPI-1640培養(yǎng)基并設(shè)實(shí)驗(yàn)空白對(duì)照組，即不含NS-398的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，取出玻片，PBS沖洗數(shù)次，體積分?jǐn)?shù)4%的多聚甲醛固定。COX-2免疫細(xì)胞化學(xué)染色，操作按試劑盒說明書進(jìn)行。用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照組，用無NS-398干預(yù)組作為陽性對(duì)照組。判斷標(biāo)準(zhǔn):將不同濃度處理組重復(fù)40次，每張玻片置于光學(xué)顯微鏡下，隨機(jī)計(jì)數(shù)1 000個(gè)細(xì)胞(獨(dú)立高倍視野)中的陽性細(xì)胞數(shù)，用 Gatalica等［4］的半定量分析法，即對(duì)每張切片的陽性細(xì)胞率及陽性細(xì)胞著色強(qiáng)度分別進(jìn)行分級(jí)計(jì)分，然后根據(jù)2項(xiàng)乘積確定其陽性強(qiáng)度。將染色強(qiáng)度分為4級(jí):無染色為0分，弱染色1分，中等染色2分，強(qiáng)染色3分，陽性細(xì)胞百分率:＜5%為0分，5% ～25%為1分，26% ～75%為2分，＞75%為3分;然后進(jìn)行組織評(píng)分(H)=染色強(qiáng)度計(jì)分(I)×陽性細(xì)胞百分率計(jì)分(P)，0～1分為陰性(－)，2～3分為弱陽性(+)，4～6分為陽性(++)，＞6分為強(qiáng)陽性(+++)。本研究以陽性及強(qiáng)陽性記為陽性數(shù)據(jù)，以陰性及弱陽性記為陰性數(shù)據(jù)。

1.2.4 ELISA法測定SGC-7901細(xì)胞釋放的 PGE2將呈對(duì)數(shù)生長期的SGC-7901細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，以每孔1×105個(gè)的密度接種于24孔板，每孔1 mL。常規(guī)培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液分組加藥物。實(shí)驗(yàn)組NS-398 濃度分別為 50、100、200 μmol·L－1，對(duì)照組加培養(yǎng)液。培養(yǎng)48 h后分別收集上清，存于－20℃中備用。取上述細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按ELISA試劑盒說明書進(jìn)行測定PGE2。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率 選對(duì)數(shù)生長期的SGC-7901細(xì)胞，2.5 g·L－1胰蛋白酶消化成單細(xì)胞懸液后，用培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為每孔1×105個(gè)，接種于6孔培養(yǎng)板，每孔1.5 mL。細(xì)胞貼壁后棄去培養(yǎng)液分組加藥物。實(shí)驗(yàn)組NS-398濃度分別為50、100、200 μmol·L－1，對(duì)照組加培養(yǎng)液。培養(yǎng) 48 h 后分別收集每孔細(xì)胞，再經(jīng)預(yù)冷的PBS洗3次，按Alexa Fluor 488Annxin V/PI試劑盒提供的方法依次加入結(jié)合緩沖液、Alexa Fluor 488Annxin V和PI，常溫避光15～30 min后經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測并讀取細(xì)胞凋亡率。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以±s表示。對(duì)符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用方差分析，多組間指標(biāo)的比較均采用單因素方差分析，LSD-t及SNK-q檢驗(yàn)。細(xì)胞染色結(jié)果比較采用χ2檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 NS-398對(duì)SGC-7901細(xì)胞生長抑制曲線 NS-398以時(shí)間劑量依賴性方式抑制SGC-7901細(xì)胞的生長，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，不同濃度的NS-398作用24、48、72 h后細(xì)胞抑制率均逐漸上升(P＜0.05)。見表1。

表1 不同濃度NS-398在不同時(shí)間對(duì)SGC-7901細(xì)胞的抑制率 %

2.2 NS-398對(duì)SGC-7901細(xì)胞COX-2蛋白的表達(dá)COX-2免疫陽性染色在光鏡下表現(xiàn)為胞漿和胞核呈棕黃色顆粒，陰性細(xì)胞表現(xiàn)為胞漿和胞核未見明顯棕黃色染色顆粒。結(jié)果顯示:COX-2在SGC-7901細(xì)胞的胞漿及胞核中成高表達(dá)，陽性表達(dá)率為95.03%;經(jīng)50、100、200 μmol·L－1的 NS-398 作用 48 h 后的 SGC-7901細(xì)胞COX-2蛋白表達(dá)明顯減弱，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);隨著NS-398濃度的增加，COX-2蛋白表達(dá)呈下降趨勢，且實(shí)驗(yàn)組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。見表2、3，圖1。

表2 不同濃度NS-398作用于SGC-7901細(xì)胞48 h后COX-2蛋白的表達(dá)

表3 不同濃度NS-398作用于SGC-7901細(xì)胞48 h后的COX-2蛋白表達(dá)率

2.3 NS-398作用SGC-7901細(xì)胞后PGE2的檢測結(jié)果 NS-398可明顯抑制PGE2的釋放，且呈劑量依賴效應(yīng)，0、50、100、200 μmol·L－1的 NS-398 作用 SGC-7901細(xì)胞48 h后，PGE2的釋放量呈下調(diào)趨勢，實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，各實(shí)驗(yàn)組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表4。

表4 不同濃度的NS-398作用于SGC-7901細(xì)胞后PGE2表達(dá)

2.4 細(xì)胞凋亡率檢測 0、50、100、200 μmol·L－1的NS-398作用SGC-7901細(xì)胞48 h后，SGC-7901細(xì)胞的凋亡率明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。隨著藥物濃度的增加，凋亡率呈上調(diào)趨勢，且各實(shí)驗(yàn)組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表5。

表5 不同濃度的NS-398對(duì)SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響

3 討論

COX-2是花生四烯酸/前列腺素代謝中的一個(gè)關(guān)鍵限速酶，與COX-1不同，COX-2在人體為誘導(dǎo)性酶，在生理狀態(tài)下靜息組織內(nèi)不表達(dá)，而在致炎因子、損傷、生長因子、致瘤因子等作用下可誘導(dǎo)其迅速表達(dá)。近年來，越來越多研究［5－6］發(fā)現(xiàn) COX-2在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中產(chǎn)生重要作用，許多惡性腫瘤內(nèi)都能檢測到COX-2的高表達(dá)，如乳腺癌、肺癌、大腸癌和鼻咽癌等。研究表明，在胃癌細(xì)胞中COX-2也存在高表達(dá)，且其表達(dá)程度與胃癌預(yù)后密切相關(guān)［7］。本實(shí)驗(yàn)研究也證明COX-2在胃癌細(xì)胞中存在高表達(dá)，提示，COX-2可能與胃癌的發(fā)生存在相關(guān)性，研究發(fā)現(xiàn)COX-2的高表達(dá)不僅代表腫瘤的早期事件，且與腫瘤的浸潤程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及患者的預(yù)后密切相關(guān)［8－9］。目前認(rèn)為COX-2的致腫瘤機(jī)制包括:誘導(dǎo)腫瘤血管生成、抑制腫瘤凋亡、增加腫瘤發(fā)生和侵襲的能力、免疫抑制等［10－11］。

前列腺素作為第二信使，與其受體結(jié)合，可發(fā)揮多種生物學(xué)效應(yīng)。如促進(jìn)細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)血管的生成、刺激腫瘤細(xì)胞的生長、抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡等。COX-2的高表達(dá)增加了PGE2的合成，PGE2可抑制樹突狀細(xì)胞成熟，抑制CD8+T細(xì)胞的活性，抑制人白細(xì)胞抗原Ⅰ和Ⅱ的表達(dá)，從而減少機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)突變細(xì)胞的免疫監(jiān)視作用［12］，此外，PGE2可誘導(dǎo)Bcl-2的表達(dá)，后者參與了內(nèi)源性凋亡途徑(線粒體凋亡途徑)，可阻止細(xì)胞色素C從線粒體向胞漿釋放，而該環(huán)節(jié)位于半胱氨酸蛋白酶caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)上游［13］，因此阻斷了內(nèi)源性凋亡途徑，導(dǎo)致細(xì)胞在增殖與凋亡中失衡，從而導(dǎo)致腫瘤的產(chǎn)生。理論上可通過抑制COX-2的表達(dá)而使PGE2的產(chǎn)生減少，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。

由于COX-2致癌途徑成為了許多腫瘤發(fā)生、發(fā)展及抗凋亡重要途徑，因此作者推測COX-2可能成為腫瘤靶向治療的很好位點(diǎn)，這促使研究選擇性COX-2抑制劑抑制腫瘤細(xì)胞生長的可能性。

本研究主要觀察選擇性COX-2抑制劑NS-398對(duì)SGC-7901細(xì)胞株的增殖、凋亡的影響，并初步探討其可能的機(jī)制。MTT、流式細(xì)胞儀檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，NS-398對(duì)SGC-7901細(xì)胞具有明顯的抑制、促凋亡作用，并呈現(xiàn)良好的時(shí)間和劑量雙效依賴性，作者推測可能與NS-398通過對(duì)COX-2的抑制作用而活化誘導(dǎo)凋亡信號(hào)caspase-3活性、抑制Bcl-2的表達(dá)、提升介導(dǎo)凋亡的轉(zhuǎn)化生長因子TGFβ2受體水平以及抑制抗凋亡關(guān)鍵激酶Akt活性相關(guān)。免疫組化、ELISA法檢測結(jié)果顯示，COX-2在SGC-7901細(xì)胞株中呈現(xiàn)高表達(dá)，PGE2在SGC-7901存在高釋放量，這與國內(nèi)外許多學(xué)者研究結(jié)果一致［14－15］，經(jīng) NS-398作用48 h后 COX-2的表達(dá)量明顯減少、PGE2的釋放呈下調(diào)趨勢，并呈劑量依賴性，同時(shí)細(xì)胞凋亡水平上升。作者推測可能與抑制COX-2-PGE2依賴途徑，抑制Bcl-2的表達(dá)，阻斷內(nèi)源性凋亡途徑相關(guān)。因此本研究結(jié)果證實(shí)選擇性COX-2抑制劑NS-398在體外可通過COX-2依賴途徑，誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，抑制胃癌細(xì)胞增殖，這為COX-2抑制劑有可能用于胃癌的預(yù)防和治療提供了一定的實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。

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