高效液相色譜法測定四環素片的含量

廣東省韶關市食品藥品檢驗所（512028）嚴曉明 朱興保 劉旺培

廣東省韶關市皮膚病醫院（512000）李志林

四環素片是具有廣譜抑菌作用（高濃度時具殺菌作用）的四環素類抗生素口服制劑，是目前生產和臨床應用最久的抗生素之一，對革蘭氏陰性菌和陽性菌均有抑制作用，臨床上多用于呼吸道、腸道、泌尿道感染。衛生部藥品標準[1]收載的四環素片的含量測定方法為中國藥典規定的抗生素微生物檢定法，該方法檢驗周期長，準確度差，操作繁瑣，影響因素較多，不能滿足批量生產質量控制的需要。因此，筆者采用高效液相色譜法取代效價法測定四環素片的含量，檢驗周期短、結果準確、重現性好、穩定性好，現報道如下。

1 儀器與試藥

Agilent 1200高效液相色譜系統（美國安捷倫公司），包括G1322A 真空脫氣機，G1311A四元泵，G1329A自動進樣器，G1316A柱溫箱，G1314B可變波長紫外檢測器；鹽酸四環素對照品（中國藥品生物制品檢定所，含量為88.2%，批號為130488-200403）；四環素片和四環素陰性對照品（廠家提供，樣品批號分別為20100803，20100903，20101003，規格為0.25g）；水為純化水，甲醇為色譜純，磷酸為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：SUPELCO Discovery C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：0.1%磷酸-甲醇（40∶60）；流速：1.0ml/min；柱溫：30℃；檢測波長：268nm；進樣量：10μl。

2.2 溶液制備 精密稱定鹽酸四環素對照品10.13mg，置于100ml容量瓶中，用0.1mol/L鹽酸溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液。取四環素片10片，精密稱定，研細，精密稱取0.1488g（約相當于四環素100mg），置于200ml容量瓶中，用0.1mol/L鹽酸溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密吸取濾液10ml，置于50ml容量瓶中，用0.1mol/L鹽酸溶液稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。取不含四環素的陰性對照品，按供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。

2.3 方法學考察 系統適用性試驗：取2.2項下3種溶液，按擬訂方法進行測定。結果顯示，陰性對照品溶液在與對照品溶液色譜峰相應保留時間位置上未出現吸收峰，由此可見，其他成分對四環素測定無干擾，四環素的保留時間約為3min，理論板數按四環素峰計算不低于10000，該方法專屬性良好。

2.4 線性關系考察 精密吸取對照品溶液1，2.5，5，10，20，40，80μl注入液相色譜儀中，記錄色譜圖，測定峰面積（見附圖）。以進樣量為橫坐標X、峰面積為縱坐標Y作圖，得線性回歸方程Y=2309.03X+332.64，r=0.9983（n=7）。結果表明，四環素進樣量在0.1～8.0μg范圍內與峰面積線性關系良好。

2.5 精密度試驗 精密吸取對照品溶液10μl，重復進樣6次，結果顯示，峰面積平均值為2619.33，RSD為0.22%（n=6），這表明儀器精密度良好。

2.6 重現性試驗 取同一批號樣品，依供試品溶液制備方法制備6份供試品溶液，分別測定峰面積，計算四環素含量。結果測得平均含量為95.66%，RSD為0.35%（n=6），試驗結果表明該法重現性良好。

附表 四環素加樣回收試驗測定結果(n=6)

2.7 穩定性試驗 取同一供試品溶液10μl，依法分別于0，2，4，6，8，10，12h進樣，記錄色譜峰面積。結果RSD為0.52%（n=6），試驗結果表明，供試品溶液在室溫條件下12h內穩定。

2.8 加樣回收試驗 精密稱取已知含量的樣品6份，分別精密加入一定量鹽酸四環素對照品，按供試品溶液制備方法制備，依法測定，計算回收率，結果見附表。

2.9 樣品含量測定 取3批樣品，依法制備供試品溶液，精密吸取10μl，測定峰面積，按外標法計算含量。結果顯示，高效液相色譜法所測樣品中四環素含量分別為93.35%，93.78%，93.53%，中國藥典2010年版[2]收載的微生物檢定法所測樣品中四環素含量分別為93.46%，93.82%，93.69%。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇 取鹽酸四環素對照品用0.1mol/L鹽酸溶液溶解并制成每1ml中含1mg的溶液，在200nm～400nm的波長范圍內掃描，由色譜圖看出，四環素在218nm，268nm，355nm處有典型最大吸收，考慮儀器末端吸收和線性范圍關系，選擇268nm為檢測波長[2]。

3.2 本方法出峰時間為3min，在5min內可完成一次測定，這明顯使檢驗周期縮短，工作效率提高。可適當調整流動相的比例以及流速，以使色譜主峰與相鄰的雜質峰有良好的分離度。

3.3 用0.1%磷酸-甲醇（40∶60）作流動相進行雜質分離預試驗，即取鹽酸四環素對照品和4-差向四環素、差向脫水四環素、鹽酸金霉素及脫水四環素對照品的混合溶液10μl注入液相色譜儀測定。結果表明，各組分的分離度均符合要求，說明雜質對含量測定無干擾。

3.4 用HPLC法測定四環素的含量，與微生物檢定法進行比較，測定結果二者基本一致。并且HPLC法準確度高，靈敏性好，簡單易行，有利于縮短檢驗周期，提高工作效率，可用于四環素片的質量控制。