乳酸菌對DSS誘導的潰瘍性結腸炎小鼠腸道通透性影響

李 丹，鄭軍紅，李金敏，程秀芳，谷 巍

(山東寶來利來生物工程股份有限公司，山東泰安271000)

腸黏膜通透性是指分子由非載體依賴擴散的方式通過腸道上皮細胞層的過程，也是指某一特定物質在腸黏膜表面通過非易化擴散方式滲透的能力［1］。有研究［2，3］表明，腸黏膜通透性的改變可發生在腸道出現明顯的炎性改變前。腸道炎癥加重時，腸黏膜通透性則進一步明顯增加。腸黏膜屏障是機體內外聯系的重要界面，若在各種病理因素作用下腸黏膜受損則引起腸內外多種炎性失調，引起腸黏膜損傷、萎縮，腸通透性增加，腸道菌群失調［4］，尤其體現在潰瘍性結腸炎、感染性結腸炎及腸外等疾患，腸黏膜屏障的改善對這些疾病不僅有助于控制病情，提高療效，對危重疾病的發生、發展、轉歸也有十分重要的意義。本研究選用該公司菌種保藏中心兩株乳酸桿菌(植物乳桿菌BLP、嗜酸乳桿菌2467)經過嚴格篩選鑒定，并通過體外模擬胃腸環境抗性、體外抑菌能力等優選菌株，最終確定為我們的實驗用菌。通過D－乳酸的測定，研究灌胃乳酸菌菌液對右旋葡聚糖硫酸鈉(dextran sulphate sodium，DSS)誘導的急性潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)小鼠腸黏膜通透性的影響，為臨床應用益生菌治療UC提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性昆明種小鼠60只，鼠齡6～7周，體重18～22 g，購于山東泰邦生物制品有限公司(許可證號:SCXK(魯)2009－0004);葡聚糖硫酸鈉購自MP Biomedicals公司;血D－乳酸試劑盒購于上海越研生物;菌株由本公司菌種保藏中心提供。

1.2 方法

1.2.1 分組及模型建立 給小鼠5%DSS溶液自由飲用7d制備急性潰瘍性結腸炎模型［5］，造模前2 d進行治療觀察。將60只昆明種小鼠隨機分為4個組，正常對照組:自由采食飲水，無菌0.9%氯化鈉溶液灌胃;模型對照組:自由飲用5%DSS溶液，無菌0.9%氯化鈉溶液灌胃;乳酸菌(植物乳桿菌BLP)1組:自由飲用5%DSS溶液，并且每日菌液(5×109cfu·mL－1，15 mL·kg－1)灌胃;乳酸菌(嗜酸乳桿菌 2 471)2組:自由飲用5%DSS溶液，并且菌液(5×109cfu·mL－1，15 mL·kg－1)灌胃，共 9 d。

1.2.2 受試物制備 將乳酸菌以2%接種量接種到MRS培養基中，37℃靜置厭氧培養24 h，活菌計數。菌液4 000 r·min－1離心 10 min，離心上清液配制成濃度5 ×109cfu·mL－1。

1.2.3 檢測指標

1.2.3.1 疾病活動指數評分 疾病活動指數評分［6］(disease activity index，DAI)，DAI=(體質量下降分數+大便性狀分數+便血分數)/3;正常大便為干而小粒狀，半稀便為糊狀但不粘肛門，稀便為液狀而且黏肛門，大便隱血用聯苯胺法檢測。體質量下降分數分為5級，0分:無下降，1分:下降1% ～5%，2分:下降6% ～10%，3分:下降11% ～15%，4分:下降＞15%;大便性狀正常記為0分，半稀便記為2分，稀便記為4分;便血陰性為0分，隱血陽性為2分，肉眼血便為4分。

1.2.3.2 標本的采集與處理 實驗第9天小鼠摘眼球取血，游離并取出結腸，迅速剖開，用預冷無菌生理鹽水沖洗干凈，于結腸處剪取1 cm長結腸，10%的中性甲醛固定液固定。石蠟包埋、切片，HE染色，進行組織學損傷評分(colon mucosal damage index，CMDI)，共分為5級，0 分:正常結腸黏膜，1分:隱窩腺體丟失1/3，2分:隱窩腺體丟失2/3，3分:隱窩腺體全部丟失，黏膜上皮完整，伴有輕度炎細胞浸潤，4分:黏膜上皮糜爛、破壞，伴有明顯炎細胞浸潤。

1.2.4 統計方法 實驗數據采用SPSS13.0軟件進行處理，測定實驗結果用均數±s標準差表示。

2 結果

2.1 疾病活動指數評分 正常對照組小鼠活動如常、毛發有光澤、飲食量正常、體重增加，DAI始終穩定在低水平。模型對照組小鼠精神萎靡、毛發無光澤、飲食量減少，體重下降，并且出現稀便、血便，DAI呈逐漸上升趨勢，第9天達到最高值。制劑1、2組小鼠一般狀況隨治療給藥時間延長逐漸好轉，飲食量增加，血便減少或消失，DAI值均低于模型對照組，第7天DAI有明顯降低。由表1可見，模型組小鼠DAI值明顯高于正常對照組(P＜0.01)，乳酸菌1、2組與模型組比較降低(P＜0.01)，乳酸菌1、2組組間差異不顯著(P＞0.05)。

表1 小鼠DAI值、CMDI值及血D－乳酸含量

2.2 組織學損傷評估

如圖1～4所示:正常對照組小鼠結腸可見黏膜上皮細胞完整，腺體排列整齊，隱窩正常;模型對照組可見炎癥主要累及黏膜、黏膜下層，上皮細胞缺失，浸潤的炎癥細胞以中性粒細胞為主，黏膜下層增厚，水腫嚴重;乳酸菌1、2組小鼠結腸黏膜仍有少量炎細胞浸潤，腺體排列基本整齊，黏膜上皮細胞相對完整，有局部脫落，水腫較輕。

2.3 血D－乳酸含量 D－乳酸是細菌發酵的代謝產物，腸道多種細菌均可產生。當腸道發生急性缺血等損傷致腸黏膜絨毛頂端上皮脫落，細胞旁路徑增加而致腸黏膜通透性增加時，腸道中細菌產生的大量D－乳酸通過受損腸黏膜進入血液中，而哺乳動物不具備將其快速降解的酶系統，通過檢測血清D－乳酸濃度，能有效判斷腸黏膜修復及評估腸道通透性改變情況。由表1可見，模型對照組D－乳酸水平顯著高于正常對照組，黏膜通透性明顯增加。乳酸菌1、2組與模型對照組比較是降低的，并且差異顯著。說明灌胃植物乳桿菌BLP、嗜酸乳桿菌2467菌液對小鼠腸黏膜通透性有改善。

3 討論

益生菌是對健康有益的活菌或活菌性膳食補充劑，利用益生菌的內源性防御屏障和免疫性防御屏障作用拮抗致病菌來保護腸黏膜屏障，促進腸上皮細胞黏蛋白及sIgA的分泌，修復腸道黏膜屏障等作用，減少菌群易位和降低內毒素濃度等。孫瑩杰［7］等研究發現益生菌可在一定程度上抑制炎性反應，降低大鼠小腸黏膜通透性和細菌易位率，從而改善大鼠小腸黏膜屏障功能。王旭霞［8］等研究發現雙歧桿菌可通過降低腸道通透性，調節抑制細胞因子，對大鼠結腸炎腸道黏膜發揮保護作用。White等［9］報道乳酸桿菌屬(LP299)在防止腸壁通透性的發展中也起到了重要的作用。

為了探討本實驗兩株乳酸菌對小鼠腸道黏膜通透性的改變，我們建立了DSS誘導的小鼠UC模型。造模過程中，小鼠出現體重下降、稀便、便血，解剖發現結腸黏膜充血、水腫、糜爛、出血及小潰瘍形成等類似人類UC的癥狀，病理組織學切片可見腸上皮細胞和腺體破壞，有炎癥細胞浸潤等，符合急性炎癥的組織病理學改變，說明所建立的小鼠急性UC模型是成功的。

腸黏膜通透性增加時腸道中細菌所產生的大量D－乳酸通過受損黏膜進入血液循環，因此D－乳酸水平可以反映腸道屏障功能變化［10］。通過對小鼠乳酸桿菌菌株發酵液灌胃處理，UC癥狀比模型對照組出現的晚且癥狀較輕，小鼠血D－乳酸濃度較模型對照組明顯降低，提示補充植物乳桿菌BLP、嗜酸乳桿菌2467可降低UC小鼠腸黏膜通透性，促進腸黏膜屏障恢復。腸黏膜通透性的改善有助于控制病情，提高療效，對危重疾病的發生、發展、轉歸也有十分重要的意義，本研究為乳酸菌預防保健、臨床治療改善腸壁通透性提供了理論支持。

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