炮制方法對木瓜中齊墩果酸和熊果酸含量的影響

王光寧，崔升淼，梁炳健

(廣東藥學院中藥學院，廣東 廣州510006)

木瓜為薔薇科植物貼梗海棠Chaenomeles speciosa(Sweet)Nakai干燥近成熟果實，習稱“皺皮木瓜”，具有舒筋、活絡、健脾開胃、鎮(zhèn)痛消腫、舒肝止痛、祛風除濕的功效，主要化學成分有黃酮類化合物、萜類化合物、有機酸類、鞣質(zhì)、多糖、果膠等［1］。齊墩果酸和熊果酸是木瓜中主要藥效成分之一，具有保肝、抗腫瘤的作用［2］。已有文獻對木瓜藥材中齊墩果酸和熊果酸的含量研究［3，4］，作者未見文獻報道不同炮制方法對木瓜中的齊墩果酸和熊果酸的含量比較分析研究，因此本試驗考察木瓜常見五種炮制品中齊墩果酸和熊果酸的含量變化，探討炮制過程中溫度、時間和輔料對化學成分的影響。

1 實驗材料

1.1 儀器 Waters 2695型高效液相色譜儀(Waters 2996二極管陣列檢測器);超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);十萬分之一電子天平BP211D、恒溫水浴鍋、中藥粉碎機、數(shù)字顯示干燥箱。

1.2 試藥

1.2.1 試劑 甲醇(分析純)，磷酸(分析純)，三乙胺(分析純)，甲醇(色譜純)，屈臣氏蒸餾水、黃酒(四川巨龍食品有限公司)為食品級。

1.2.2 藥材及對照品 木瓜藥材(購于廣州柏盛堂中藥有限公司，由廣東藥學院中藥學院中藥資源系馬鴻雁博士鑒定為薔薇科植物貼梗海棠Chaenomeles speciosa(Sweet)Nakai干燥近成熟果實)，齊墩果酸對照品(供含量測定用，批號:110713－200910，中國藥品生物制品檢定所)，熊果酸對照品(供含量測定用，批號:110713－200910，中國食品藥品檢定研究院)

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:Kromat Universil C18色譜柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流動相:甲醇 － 水(0.4% 磷酸，0.15%三乙胺)=87∶13;紫外檢測波長為215 nm;柱溫:25℃;流速為 0.75 mL·min－1;進樣量:20 μL。齊墩果酸和熊果酸的分離度良好。

圖1 空白、對照品與樣品HPLC圖

2.2 對照品溶液的制備

2.2.1 齊墩果酸 取齊墩果酸對照品，精密稱定0.049 5 g，置于10 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，備用;精密量取齊墩果酸儲備液1 mL置5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濃度為 0.99 mg·mL－1。

2.2.2 熊果酸 取熊果酸對照品，精密稱定0.052 0 g，置于10 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，備用;精密量取齊墩果酸儲備液1 mL置5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濃度為 1.04 mg·mL－1。

2.3 樣品溶液的制備 通過查閱相關文獻［5］及各省市炮制規(guī)范整理出常用的木瓜飲片有以下五種。

2.3.1 生品 取木瓜飲片，置60℃烘箱中干燥1 h，取出，待涼后置干燥器中保存。取干燥過的飲片，粉碎，取1.0 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加入甲醇50 mL，稱定重量，加熱回流1 h，靜置冷卻，稱定重量用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.2 炒黃品 取干燥木瓜飲片20 g，置炒制容器中，用文火加熱，炒至表面微黃，取出放涼，篩去碎屑，再按生品的制備方法制備樣品溶液。

2.3.3 炒焦品 取干燥木瓜飲片20 g，置炒制容器中，用文火加熱，炒至表面微焦，取出放涼，篩去碎屑，再按生品的制備方法制備樣品溶液。

2.3.4 鹽炙品 取干燥木瓜飲片20 g，照2010版《中國藥典》附錄炮制通則［6］，加鹽水拌勻(食鹽用量2%)，悶透，置炒制容器內(nèi)，以文火加熱，炒至規(guī)定的程度時，取出，放入60℃烘箱烘干，取出，再按生品的制備方法制備樣品溶液。

2.3.5 酒炙品 取干燥木瓜飲片20 g，照2010版《中國藥典》附錄炮制通則［6］，加黃酒(10% ～20%)拌勻，悶透，置炒制容器內(nèi)，以文火加熱，炒至規(guī)定的程度時，取出，放入60℃烘箱烘干，取出，再按生品的制備方法制備樣品溶液。

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關系 精密量取齊墩果酸對照品溶液0.2、0.5、1、2、4、6 mL 置 10 mL 容量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，注入色譜儀。以峰面積(Y)對濃度(X)計算回歸方程Y=5×106X－25 774，R2=0.999 5，線性范圍 0.019 8 ～0.594 0 mg·mL－1。

精密量取熊果酸對照品溶液 0.2、0.5、1、2、3、6 mL 置 10 mL容量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，注入色譜儀。以峰面積(Y)對濃度(X)計算回歸方程為 Y=6×106X－137 67，R2=0.999 8，線性范圍0.020 8 ～0.624 0 mg·mL－1。

2.4.2 精密度試驗 取同一份樣品溶液，連續(xù)重復進樣6次，記錄峰面積。結(jié)果齊墩果酸RSD為1.92%，熊果酸RSD為1.45%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 重復性試驗 精密稱取同一批樣品6份，按2.3項下方法制備樣品溶液，并按2.1項下色譜條件測定，記錄峰面積，計算齊墩果酸和熊果酸的含量。結(jié)果齊墩果酸平均含量為 0.166 0%，RSD為 1.09%，熊果酸平均含量為0.241 1%，RSD為1.51%;表明該方法重復性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、14、16、18、20、24 h 測定記錄峰面積。結(jié)果齊墩果酸RSD為0.99%，熊果酸RSD為0.95%，表明供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗 取已知齊墩果酸和熊果酸含量的樣品約0.5 g，精密稱定，平行6份，分別精密加入0.91 mg·mL－1齊墩果酸對照品溶液和1.02 mg·mL－1熊果酸對照品溶液各1 mL，甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，注入色譜儀記錄峰面積，計算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(n=6)

2.5 樣品含量測定 取木瓜各炮制品平行3份，分別按2.3項下方法制成樣品溶液，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，注入色譜儀，按2.1項下色譜條件進行測定，按外標法計算齊墩果酸和熊果酸的含量，結(jié)果見表2。

表2 木瓜各炮制品中齊墩果酸和熊果酸的含量(%，n=3)

結(jié)果表明:鹽炙品中齊墩果酸的含量最高，炒黃品中熊果酸含量和兩者總量最高;而炒焦品中兩者含量均為最低，均明顯低于生品，炒黃品、鹽炙品和酒炙品中兩者的含量均比生品有不同程度的增加。

3 討論

3.1 色譜條件的考察

3.1.1 檢測波長 齊墩果酸和熊果酸屬于同分異構體，結(jié)構相似，HPLC分離中常出現(xiàn)兩種物質(zhì)保留時間接近，難以分離，且分子中只有一個雙鍵，屬末端吸收，流動相甲醇的吸收在205 nm附近，極易引起干擾;在210 nm波長處齊墩果酸和熊果酸峰前常有雜峰，影響分離;在215 nm波長處，齊墩果酸和熊果酸峰型較對稱、分離度較好，因此選用215 nm作為檢測波長。

3.1.2 流動相 參考相關文獻和2010版《中國藥典》中關于HPLC分離齊墩果酸和熊果酸的流動相，再結(jié)合試驗摸索結(jié)果表明，出峰時間隨著堿加入有所延遲，峰型變好，分離度也較好，同時發(fā)現(xiàn)隨著比例的細小改變，出峰時間和峰型也有著顯著變化，最后確定甲醇－水(0.4%磷酸，0.15%三乙胺)=87∶13作為流動相，峰型較好，分離度較大。

3.2 含量結(jié)果分析 從試驗結(jié)果分析可看出，炮制的溫度和時間是影響齊墩果酸和熊果酸含量變化的主要因素，文火炒黃后兩者成分含量較高，隨著炒制時間延長、溫度升高炒焦品中兩者含量明顯下降。加熱溫度和時間是如何影響齊墩果酸和熊果酸含量，在炮制過程中如何控制條件避免成分損失需要進一步的研究和探索。

［1］吳虹，魏偉，吳成義.木瓜化學成分及藥理活性的研究［J］.安徽中醫(yī)學院學報，2004，23(2):62 －64.

［2］王宏賢.木瓜保肝降酶作用的實驗研究［J］.世界中西醫(yī)結(jié)合雜志，2007，2(4):213 －214.

［3］陳建真，敖志輝，陳建明，等.不同產(chǎn)地和品種木瓜及其酒制品中齊墩果酸和熊果酸的含量測定研究［J］.中華中醫(yī)藥學刊，2011，29(10):2194 －2196.

［4］呂美紅，謝曉梅，查孝柱，等.反相高效液相色譜法測定木瓜藥材及飲片中齊墩果酸和熊果酸含量［J］.安徽中醫(yī)學院學報，2010，29(3):72 －75.

［5］胡居杰，汪電雷.木瓜炮制歷史沿革［J］.安徽中醫(yī)學院學報，2000，19(6):42.

［6］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2010年版(一部)［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:402－403.