HPLC法測定鹽酸氨溴索注射液的含量和有關物質

付 建，蘇貴勇，趙海橋

(1.山東方明藥業集團股份有限公司，山東菏澤274500;2.中國藥科大學，江蘇南京210009;3.山東大學藥學院，山東 濟南250012)

鹽酸氨溴索(Ambroxol hydrochloride)為溴己新的體內活性代謝物，適用于伴有痰液分泌不正常及排痰功能不良的急性、慢性肺部疾病的治療;手術后肺部并發癥的預防性治療;早產兒及新生兒的嬰兒呼吸窘迫癥(IRDS)的治療。《中國藥典》2010年版［1］僅收載了原料藥及口服制劑的含量和有關物質測定方法，對注射液并未收載，進口藥品注冊標準(標準號:JX20030067)及文獻［2］雖采用高效液相色譜法測定其含量和有關物質，但對鹽酸氨溴索中可能存在的雜質沒有控制，流動相組成及方法各不相同，本文建立了新的高效液相色譜法測定鹽酸氨溴索注射液的含量和有關物質，該方法快速、準確、重現性好、靈敏度高，可用于鹽酸氨溴索注射液的質量控制。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀(日本Shimadzu系列，LC－10Avp泵，SPD－10Avp紫外檢測器，CBM－10A plus系統控制器)，Five Easy 20型精密 pH計(瑞士 Mettler Toledo)，AB265S型電子天平(瑞士Mettler Toledo)。

1.2 試藥及試劑 鹽酸氨溴索注射液(Boehringer Ingelheim Espana，S.A.西班牙勃林格殷格翰公司生產，規格 2 mL∶15 mg，批號S0423;山東方明藥業集團股份有限公司試制樣品，規格 2 mL∶15 mg，批號 081201，081202，081203)。鹽酸氨溴索對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號:100694－200401;含量:100.0%)，鹽酸氨溴索雜質 B［反式 －4 －(6，8－二溴－1，4二氫喹唑啉－3(2H)－基)環己醇，批號:05.04.08.06;含量:97.9%］，鹽酸氨溴索雜質 C(反式 －4 －［［(E)－2－氨基 －3，5－二溴芐基］氨基］環己醇，批號:05.03.09.03;含量:96.6%)，鹽酸氨溴索雜質 D(順式 －4 －［(2 － 氨基 －3，5 二溴芐)氨基］環己醇，批號:05.05.09.12;含量:98.6%)，以上三種有關物質均為歐洲藥典標準品，購于德國LGC有限公司。乙腈為色譜純;其他試劑為分析純，水為本公司制水車間生產純化水。

2 方法與結果

2.1 鹽酸氨溴索含量測定

2.1.1 樣品溶液的制備 精密量取本品樣品2 mL，兩份平行樣，置100 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻。

2.1.2 色譜條件 用 Welchrom －C18(4.6 mm ×200 mm，5 μm)色譜柱;以0.01 mol·L－1磷酸氫二銨溶液(用磷酸調pH值至7.0)－乙腈(50∶50)為流動相;檢測波長為248 nm;流速為1.0 mL·mL－1;理論板數按鹽酸氨溴索峰計算應不低于3 000。

2.1.3 線性關系試驗 精密稱取鹽酸氨溴索對照品15.21 mg，置10 mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別精密量取 0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL，各置 10 mL 量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。分別精密量取供試品溶液20μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，量取峰面積。以峰面積A為縱坐標，濃度C為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程為:A=32 395 046C+104 717，相關系數 r=0.999 9，即鹽酸氨溴索在0.091 ～0.212 mg· mL－1的濃度范圍內，其濃度與峰面積呈良好的線性關系。

2.1.4 回收率試驗 取鹽酸氨溴索對照品約12、15、18 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，按處方量加入輔料，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。每個濃度配制3份，共9份，分別編號為1～9。另稱取鹽酸氨溴索對照品約15 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。精密量取上述溶液各20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖;計算回收率。試驗結果見表1。

表1 回收率試驗結果(n=9)

由上述試驗結果可知，本法回收率良好。

2.1.5 精密度試驗 將線性項下濃度為 0.152 1 mg·mL－1的鹽酸氨溴索對照品溶液重復進樣，測其峰面積，結果RSD=0.62%(n=6)，說明本法儀器精密度良好。

2.1.6 溶液穩定性試驗 精密量取本品2 mL，置100 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。在室溫(25 ℃)條件下分別于第0、1、2、4、6、8 h，精密量取 20 μL 注入液相色譜儀，記錄色譜圖，量取峰面積，結果RSD=0.44%(n=6)，說明供試品溶液在室溫(25℃)條件下8 h內具有良好穩定性。

2.1.7 空白輔料干擾試驗 按處方比例配制空白輔料溶液，用與含量測定項下相同方法處理該溶液并在本實驗色譜條件下進樣，色譜圖見圖1。說明空白輔料對鹽酸氨溴索的含量測定無干擾。

圖1 鹽酸氨溴索對照品色譜圖

2.1.8 樣品含量測定 精密量取本品2 mL，置100 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液，另取鹽酸氨溴索對照品適量，精密稱定，加流動相溶解并稀釋制成每1 mL約含0.15 mg的溶液，作為對照品溶液，分別精密量取20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，量取峰面積，按外標法計算含量，結果四批樣品(S0423，081201，081202，081203)含量分別為 99.6%，101.6%，102.0%，100.9%。

2.2 有關物質分析

2.2.1 色譜條件 條件同“2.1.2”。

2.2.2 保留時間的測定 取有關物質B、C、D對照品，分別用流動相制成1.5 μg· mL－1的溶液，立即進樣，有關物質B、C、D 的保留時間分別為 11.1、46.0、16.2 min。

2.2.3 有關物質色譜圖 取有關物質 B、C、D對照品及鹽酸氨溴索對照品適量，用流動相溶解后，取20 μL進樣。在本實驗條件下，有關物質B、C、D及鹽酸氨溴索色譜峰分離良好，色譜圖見圖2。

圖2 鹽酸氨溴索注射液有關物質HPLC色譜圖

2.2.4 破壞性試驗 酸破壞溶液:精密量取供試品溶液2 mL，置20 mL 量瓶中，加0.1 mol·L－1的鹽酸溶液0.5 mL，加流動相適量，水浴加熱1 h，取出冷卻，用0.1 mol·L－1氫氧化鈉溶液調節pH值至中性，加流動相稀釋至刻度，搖勻，過濾，即得。取空白輔料溶液2 mL同法操作，作為酸破壞空白溶液。

堿破壞溶液:精密量取供試品溶液2 mL，置20 mL量瓶中，加 0.1mol·L－1氫氧化鈉溶液 0.5 mL，加流動相適量，水浴加熱1 h，取出冷卻，用0.1 mol·L－1鹽酸溶液調節 pH 值至中性，加流動相稀釋至刻度，搖勻，過濾，即得。取空白輔料溶液2 mL同法操作，作為堿破壞空白溶液。

氧化破壞溶液:精密量取供試品溶液2 mL，置20 mL量瓶中，加雙氧水1滴，加流動相稀釋至刻度，搖勻，過濾，即得。取空白輔料溶液2 mL同法操作，作為氧化破壞空白溶液。

高溫破壞溶液:精密量取供試品溶液2 mL，置20 mL量瓶中，加流動相適量，水浴加熱2 h，取出冷卻，加流動相稀釋至刻度，搖勻，過濾，即得。

光照破壞溶液:精密量取供試品溶液2 mL，置20 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，在照度為4 500 Lx的條件下放置2 d，過濾，即得。

精密量取上述溶液各20 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。主峰與各降解產物峰分離度均大于1.5，說明該色譜條件適用于有關物質的檢查。

2.2.5 線性關系試驗 精密稱取鹽酸氨溴索對照品18.73 mg，置100 mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別精密量取 0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL，置 50 mL 量瓶中，各加流動相稀釋至刻度，作為供試品溶液。量取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖;以鹽酸氨溴索峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，得回歸方程為 Y=33 198X+6 318.4(r=0.999 8)，結果表明，鹽酸氨溴索在 2.25 ～5.24 μg·mL－1的濃度范圍內，其濃度與峰面積呈良好的線性關系。

精密稱取鹽酸氨溴索雜質B對照品5.14 mg，置50 mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取3 mL，置20 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，分別精密量取0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL，置 10 mL 量瓶中，各加流動相稀釋至刻度，分別精密量取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖;以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，得回歸方程為Y=24 881X+742.9(r=0.999 9)，結果表明，鹽酸氨溴索雜質 B溶液在 0.91 ～2.11 μg·mL－1的濃度范圍內，其濃度與峰面積呈良好的線性關系。

精密稱取鹽酸氨溴索雜質C對照品5.08 mg，置50 mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取3 mL，置20 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，分別精密量取0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL，置 10 mL 量瓶中，各加流動相稀釋至刻度，分別精密量取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖;以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，得回歸方程為Y=33 153X+9 335.3(r=0.999 6)，結果表明，鹽酸氨溴索雜質C 溶液在0.88 ～2.06 μg·L－1的濃度范圍內，其濃度與峰面積呈良好的線性關系。

精密稱取鹽酸氨溴索雜質 D對照品10.71 mg，置100 mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取3 mL，置20 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，分別精密量取 0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL，置 10 mL 量瓶中，各加流動相稀釋至刻度，分別精密量取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖;以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，得回歸方程Y=29 720.5X+98.74(r=0.999 9)，結果表明，鹽酸氨溴索雜質D 溶液在0.95 ～2.22 μg·L－1的濃度范圍內，其濃度與峰面積呈良好的線性關系。

2.2.6 定量限試驗 精密稱取鹽酸氨溴索對照品12.62 mg，置100 mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，精密量取1 mL，置100 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，精密量取1 mL，置50 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，量取溶液20μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，由圖知，信噪比約為10∶1，即鹽酸氨溴索的定量限為0.5 ng。連續進樣6針，RSD為 2.63%。

精密稱取鹽酸氨溴索雜質B對照品5.16 mg，置50 mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，精密量取1 mL，置100 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，精密量取2 mL，置50 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，量取溶液20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，由圖知，信噪比約為10∶1，即鹽酸氨溴索雜質B的定量限為0.81 ng。連續進樣6針，RSD為3.85%。

精密稱取鹽酸氨溴索雜質D對照品5.27 mg，置50 mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，精密量取1 mL，置100 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，精密量取2 mL，置50 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，量取溶液20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，由圖知，信噪比約為10∶1，即鹽酸氨溴索雜質D的定量限為0.83 ng。連續進樣6針，RSD為2.55%。

精密稱取鹽酸氨溴索雜質C對照品5.09 mg，置50 mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，精密量取1 mL，置50 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，精密量取2 mL，置50 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，量取溶液20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，由圖知，信噪比約為10∶1，即鹽酸氨溴索雜質C的定量限為1.57 ng。連續進樣6針，RSD為8.83%。

由以上試驗數據可知，本品連續進樣6針，除雜質C峰面積變化比較大，其他峰面積相對標準差均小于5.0%，符合規定。在試驗過程中觀察雜質C在溶液中不穩定。詳細數據見精密度試驗及穩定性試驗。

2.2.7 檢測限試驗 精密量取鹽酸氨溴索定量限試驗項下溶液3 mL，置10 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，量取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，信噪比約為3∶1，即鹽酸氨溴索的最小檢出量為0.25 ng。

精密量取鹽酸氨溴索雜質B定量限試驗項下溶液3 mL，置10 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，量取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，信噪比約為3∶1，即鹽酸氨溴索雜質B的最小檢出量為0.24 ng。

精密量取鹽酸氨溴索雜質D定量限試驗項下溶液3 mL，置10 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，量取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，信噪比約為3∶1，即鹽酸氨溴索雜質D的最小檢出量為0.25 ng。

精密量取鹽酸氨溴索雜質C定量限試驗項下溶液3 mL，置10 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，量取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，信噪比約為3∶1，即鹽酸氨溴索雜質C的最小檢出量為0.47 ng。

2.2.8 精密度試驗 精密稱取鹽酸氨溴索對照品9.75 mg，置50 mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 mL，置50 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，精密量取20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，連續進樣6次，量取峰面積，RSD為0.55%，鹽酸氨溴索溶液精密度良好。

取鹽酸氨溴索雜質B、雜質C、雜質D對照品，精密稱定，加流動相溶解并稀釋制成每1 mL約含1.5 μg的混合溶液，搖勻，精密量取20 μL，注入液相色譜儀，連續進樣6次，記錄色譜圖，量取峰面積，雜質B的RSD=1.39%，雜質C的RSD=6.88%。雜質D的RSD=0.56%。由以上數據可以看出，雜質B與雜質D溶液比較穩定，雜質C溶液峰面積變小，說明雜質C溶液不穩定。

2.2.9 穩定性試驗 供試品溶液穩定性:精密量取本品5 mL，置50 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，在室溫(25 ℃)條件下，分別于0、1、2、4、6、8 h，精密量取20μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按面積歸一化法計算。結果本品有關物質檢查供試品溶液在室溫(25℃)條件下，8 h內基本穩定。

雜質穩定性:取鹽酸氨溴索雜質B、雜質C、雜質D對照品，精密稱定，加流動相溶解并稀釋制成每1 mL約含1.5 μg的混合溶液，搖勻，在室溫(25 ℃)條件下，分別于 0、2、4、6、8 h，精密量取20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，量取峰面積，雜質B的RSD=1.77%，雜質C的RSD=17.45%，雜質D的RSD=1.91%。雜質B與雜質D溶液在室溫(25℃)條件下，8 h內基本穩定;雜質C溶液變化比較大，故雜質溶液需臨用新配。

2.2.10 耐用性 調整有關物質測試條件，分別考察流動相比例(45∶55、55∶45)、流動相 pH 值(6.8、7.2)、柱溫變化(30℃、35 ℃、40 ℃)、流速變化(0.8 mL·min－1、1.0 mL·min－1、1.2 mL·min－1)、檢測波長變化(243 nm、253 nm)及色譜柱變化時，測定結果的變化。在各條件下進樣，供試品溶液雜質峰均能與主峰有效分離，且在混合溶液中各雜質峰均能與主峰分離，故本色譜條件適合本品有關物質檢查。

2.2.11 樣品溶液的測定 精密量取本品5 mL，置50 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，濾過，作為供試品溶液;精密量取供試品溶液1 mL，置200 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液;另取鹽酸氨溴索雜質B、雜質C、雜質D對照品，精密稱定，加流動相溶解并稀釋制成每1 mL約含1.5 μg的混合溶液，作為對照品溶液(臨用新配)。照

2.1.2 項下的色譜條件，取對照溶液20 μL注入液相色譜儀，調節檢測靈敏度，使主成分色譜峰的峰高約為滿量程的25%，精密量取供試品溶液、對照溶液及對照品溶液各20 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分色譜峰保留時間的4倍。供試品溶液記錄的色譜圖中如顯與雜質B、雜質C或雜質D峰保留時間一致的色譜峰(雜質對照品溶液出峰順序為雜質B、雜質D、雜質C)，按外標法以峰面積計算各雜質的含量，各雜質的量不得過鹽酸氨溴索標示量的0.2%，量取各雜質峰面積的和不得大于對照溶液的主峰面積(0.5%)。各批樣品測定結果見表2。

表2 鹽酸氨溴索注射液有關物質檢查

3 討論

本實驗對HPLC法測定鹽酸氨溴索注射液含量和有關物質的方法學進行了研究，結果顯示，鹽酸氨溴索在0.091～0.212 mg·mL－1的濃度范圍內，其濃度與峰面積呈良好的線性關系，相關系數 r=0.999 9，回收率為 99.60%，RSD 為0.82%(n=9)，精密度、穩定性都較好，故該法用于測定鹽酸氨溴索注射液的含量和有關物質，專屬性強、簡便，重復性好，結果準確可靠。在有關物質測定中，隨著放置時間的延長，有關物質會增加，因此待測樣品及對照品配制好應立即進樣，而且應注意避光。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2010年版(二部)［S］.北京:中國醫藥科技出版社，2010:765－768.

［2］崔嵐，沈金芳.反相高效液相色譜法測定鹽酸氨溴索注射液的含量［J］.醫藥導報，2005，24(10):943 －944.