川西高原牦牛酸奶子乳酸菌遺傳多樣性及系統發育研究

田 鴻，蒲 彪，張小平,*

(1.四川農業大學資源環境學院，四川 成都 611134；2.四川農業大學食品學院，四川 雅安 625014)

川西高原牦牛酸奶子乳酸菌遺傳多樣性及系統發育研究

田 鴻1，蒲 彪2，張小平1,*

(1.四川農業大學資源環境學院，四川 成都 611134；2.四川農業大學食品學院，四川 雅安 625014)

采用16S rDNA基因的限制性酶切片段長度多態性分析(16S rDNA-PCR-RFLP)和16S～23S rDNA基因間區(ISR)的酶切多態性分析(ISR-PCR-RFLP)技術，研究分離自川西高原牦牛酸奶子的81株乳酸菌的遺傳多樣性，并結合16S rDNA序列分析技術研究16S rDNA-PCR-RFLP的各類群代表菌株的系統發育關系。結果表明：供試菌株共有23種16S rDNA遺傳型，供試菌株按61%相似系數可分為4個類群，按81%相似系數，可分為16個類群，結合序列分析結果，乳桿菌屬(Lactobacillus)、腸球菌屬(Enterococcus)細菌為主要類群；16S～23S rDNA基因的ISR擴增產物的酶切分析表明，供試菌株共有19種ISR遺傳型，按60%相似系數，供試菌株可分為4個類群，按80%相似系數，供試菌株可劃分為14個類群。

牦牛酸奶子；乳酸菌；相似水平；系統發育

近年來，發酵型酸奶已經成為乳品市場的重要產品，產量年增長40%以上[1]。由于國內自然發酵乳品中乳酸菌資源的收集、發酵特性、遺傳特性、系統發育關系研究、菌種鑒定以及菌種安全性研究等還比較欠缺，國內主要乳品企業生產酸奶以直接購買國外直投式發酵劑為主，與此同時，隨著小型酸奶機走入家庭，小包裝酸奶發酵劑必將成為商業發酵劑的重要產品，但是，目前采用自有知識產權菌株組配的發酵劑鮮見報道，因此亟需對國內天然發酵乳品中乳酸菌資源進行深入系統的研究。我國地域遼闊，民族眾多，藏族、維吾爾族、蒙古族等民族有制作和食用自然發酵酸奶的傳統，有研究表明這些自然發酵酸奶中含有豐富的乳酸菌資源[2-8]，研究開發這些資源對推動國內乳業可持續發展具有十分重要的戰略意義。

川西高原甘孜、阿壩地區海拔高，紫外線輻射強，牦牛奶酸奶子是生活在該區域藏民族的主食之一。酸奶子風味獨特，低溫發酵，說明川西高原牦牛酸奶子中乳酸菌具有某些特點。魯妮等[7]對酸奶子樣品中的乳酸菌進行了分離和初步鑒定；敖曉琳等[9-10]研究了分離菌株的發酵性能并初步篩選出一些優良單株；嚴以蘭等[11]對分離自該區域的幾株優良單菌株的酸堿、膽鹽等耐受性進行了研究，初步篩選出幾株抗逆性較好的菌株。通過這些工作，收集了該區域的乳酸菌資源，初步篩選出一些優良單菌株。但該區域乳酸菌分離株的遺傳多樣性和系統發育關系研究尚未見報道。

本實驗采用16S rDNA基因的限制性酶切片段長度多態性分析(16S rDNA-PCR-RFLP)和16S～23S rDNA基因間區(ISR)的酶切長度多態性分析(ISR-PCR-RFLP)技術研究分離自川西高原地區藏民族的牦牛奶酸奶子的81株乳酸菌的遺傳多樣性和系統發育關系，為進一步開發此區域乳酸菌資源打下基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

81株分離株和11株參比菌株見表1，由四川農業大學微生物學實驗室于－70℃保存。DNA提取和保存采用北京天根生化科技有限公司的DNA提取試劑盒中的試劑。酶切實驗采用BBI公司的5種限制性內切酶(HindⅢ、MspⅠ、HinfⅠ、HindⅢ和TaqⅠ)，酶切體系和酶切反應按產品說明書進行。

1.2 菌株總DNA提取

供試菌株先在MRS培養基上連續劃線活化兩代，活化后接種于5mL液體MRS培養基，42℃培養16h，12000r/min離心收集菌體，STE緩沖液(pH8.0)洗滌菌體3次，37℃條件下采用溶菌酶處理直至細胞壁溶解，用細菌DNA提取試劑盒提取菌株總DNA，TE緩沖液(pH7.4)懸浮，分裝小離心管，2%瓊脂糖凝膠水平電泳檢測提取的總DNA，－20℃保存備用，作為PCR擴增模版。

1.3 16S rDNA基因PCR-RFLP分析

以菌株總DNA為模板，選用雙向引物P1和P6擴增供試菌株的16S rDNA基因。正向引物P1：5′-CGAGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCT-3′；反向引物P6：5′-CGT ACGGCTACCTTGTTACGACTTCACC CC-3′，50μL擴增體系。反應條件：92℃、3min；94℃、1min，58℃、1min，72℃、2min，30個循環；72℃、8min。進行含溴乙錠(EB)的2%瓊脂糖凝膠水平電泳，電壓120V，時間40min，檢測擴增產物長度是否符合要求。

按實驗用酶的使用說明酶切16S rDNA基因擴增產物，酶切結束，進行溴乙錠EB的2%瓊脂糖凝膠水平電泳，電壓120V，時間3h，凝膠成像系統成像，統計各菌株酶切條帶數。采用NTSYSpc21軟件對酶切結果進行聚類分析。

1.4 16S rDNA基因的序列分析

表1 供試菌株及來源Table 1 The tested strains and the sources of collected samples

根據16S rDNA基因酶切聚類結果，選取各類群中心菌株16S rDNA基因擴增產物送上海英駿生物技術有限公司測序，測序結果提交NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih. gov)的GenBank，取得登錄號，Blast搜尋與各測序序列高一致度序列，查找高一致度序列典型菌株的16S rDNA基因序列，采用MAGA4.1軟件包中的ClustalW1.6子程序對測序序列和典型菌株16S rDNA基因序列進行多序列匹配排列，排列結果采用鄰位連接(Neighbor-Joining)法計算序列間遺傳距離，構建測序序列的系統發育樹，同時計算測序序列和GenBank中高一致度序列的相似度。

續表1

1.5 16S～23S的ISR-PCR-RFLP分析

以菌株總DNA為模板，采用雙向引物PHr和p23SR01擴增供試菌株的ISR，正向引物PHr：5′-TGCGGCTGGATCACCTCCTT-3′，反向引物p23SR01：5′-GGCTGCTTCTAAGCCAAC-3′，擴增體系50μL。反應條件：94℃、5min；94℃、1min，55℃、1min；72℃、1min，35個循環；72℃、6min。進行含EB的2%瓊脂糖凝膠水平電泳，電壓120V，時間40min，檢測擴增產物是否符合1000kb大小要求。

按實驗用酶的使用說明酶切ISR擴增產物，酶切結束，進行含EB的2%瓊脂糖凝膠水平電泳，電壓120V，時間2.5h，凝膠成像系統成像，統計各菌株酶切條帶數。采用NTSYSpc21軟件對酶切結果進行聚類分析。

2 結果與分析

2.1 16S rDNA基因的PCR-RFLP分析

圖1 4種酶切16S rDNA基因擴增產物具有較豐富酶切條帶的限制性內切酶的部分酶切結果Fig.1 Fingerprinting of 16S rDNA PCR products digested by 4 restriction enzymes

5個限制性內切酶酶切擴增產物電泳圖譜顯示不同限制性內切酶所反應的遺傳信息量不相同，4種限制性內切酶(HaeⅢ、MspI、HinfI)酶切條帶多(圖1)，尤以MspI酶切條帶最多，所反映的遺傳信息量最豐富，MspI是本實驗中揭示乳酸菌遺傳多樣性的最佳內切酶。

表2 供試菌株16S rDNA擴增產物的酶切圖譜類型Table 2 16S rDNA genotype patterns of PCR products digested by restriction enzymes

由表2可見，供試菌株有23種16S rDNA基因的遺傳型，其中第3、7、15種遺傳型是主要遺傳型，第7種遺傳型共40株，占供試菌株的43.4%。16S rDNA基因酶切聚類結果見圖2，如果按相似系數61%劃分類群，可以劃分為4個類群，其中，參考菌株B12 單獨聚群，4個16S rDNA主要遺傳型(編號1、3、7、15)，在按61%相似系數的聚類中，編號1、3和15的3個主要遺傳型16S rDNA菌株是第Ⅰ類群的主要菌株；編號為7的遺傳型菌株全部為第Ⅳ群菌株。如果按81%的相似系數，供試菌株可分為16個類群。

2.2 基于16S rDNA基因序列分析

根據圖2聚類結果，將主要類群代表菌株的16S rDNA基因進行測序，測序結果提交NCBI的GenBank，取得索引號，分別是SAU E-5(FJ462691)、SAU F-2 (GU187337)、SAU C-1(GU177634)、SAU 3-2 (GU177629)、SAU J-2(FJ462690)、SAU G-10 (GU177632)、SAU 3-12(GU177628)、SAU 2-4 (GU139738)、SAU E-16(GU177633)。通過構建測序序列的系統發育樹(圖3)，并計算測序序列與典型菌株16S rDNA基因序列的相似度。

由圖3可見，代表菌株集中于兩個屬，即乳桿菌屬(Lactobacillus)和腸球菌屬(Enterococcus)。其中菌株SAU E-5、SAU F-2、SAU C-1、SAU 3-2、SAU J-2和SAU G-10為乳桿菌屬菌株，分布于按61%相似水平的Ⅰ和Ⅳ群中，其余菌株(SAU 3-12、SAU 2-4、SAU E-16)為腸球菌屬菌株，分布于圖2的第Ⅱ群中。系統發育樹中菌株SAU E-5和Lactobacillus pentosusJCM1558T處于同一分支，相似系數為98.5%，表明與典型菌株的親緣關系較近，可能為Lactobacilluspentosus中的一個菌株。SAU F-2與短小乳桿菌Lactobacillus brevisATCC14869T處于同一分支，相似系數為97.6%；菌株SAU 3-2、SAU C-1與Lactobacillus caseiATCC334T處于同一分支，SAU 3-2與Lactobacillus caseiATCC334T的相似系數為97.8%，表明SAU 3-2和Lactobacillus caseiATCC334T親緣關系較近，SAU C-1與Lac-tobacillus caseiATCC334T為94.9%，小于97.5%，表明二者親緣關系較遠；菌株SAU J-2與Lactobacillus curvatusDSM20010T(AJ270591)處于同一分支，相似系數為95.6%，小于97.5%，二者親緣關系較遠；菌株SAU G-10與Lactobacillus fermentumATCC14931T處于同一分支，相似系數為98.2%，說明二者有較近的親緣關系。菌株SAU 3-12與Enterococcus faecalisLMG7937T處于同一分支，相似系數僅為92.4%，與典型菌株16S rDNA基因序列的相似系數小于97.5%，表明與典型菌株的親緣關系較遠。菌株SAU 2-4、SAU E-16和Enterococcus duransDSM20633T處于同一分支，但SAU 2-4與Enterococcus duransDSM20633T相似系數僅為93.7%， SAU E-16與Enterococcus duransDSM20633T的相似系數也不高，僅為93.9%，說明兩個菌株與EnterococcusduransDSM20633T親緣關系較遠。上述研究盡管采用典型菌株的16S rDNA基因序列為參比序列，但典型菌株的選擇可能對序列分析有影響，也有可能有新種。要準確確定菌株的系統發育關系還需要結合其他方法，如RecA基因[12-13]、dnaA及gyrB基因[14]、rpoA基因[15]等特殊基因的序列分析結果才能最終確定菌株的系統發育關系。

圖2 供試菌株基于16S rDNA基因擴增產物的酶切結果的聚類分析Fig.2 Dendrogram of the tested strains based on 16S rDNA-PCR-RFLP

圖3 基于16S rDNA基因序列分析的主要類群代表菌株系統發育樹Fig.3 Dendrogram of the representative strains based on 16S rDNA gene sequence analysis

2.3 供試菌株ISR擴增產物的酶切分析

2.3.1 16S～23S 的ISR酶切分析

圖4 3種酶切ISR擴增產物具有較豐富酶切條帶的限制性內切酶的部分酶切結果Fig.4 Fingerprinting of ISR-PCR products digested by 3 restriction enzymes

圖5 基于16S～23S rDNA基因的ISR擴增產物酶切結果的供試菌株聚類分析Fig.5 Dendrogram of the tested strains based on ISR-PCR-RFLP

采用5種限制性內切酶進行酶切反應，發現3種限制性內切酶(MspI、HinfI、TaqI)酶切條帶較多(圖4)，揭示的供試菌株遺傳信息豐富，能反應出供試菌株的遺傳多樣性，尤其是以HinfI酶切條帶最多，所反映的遺傳信息量最豐富。

依據ISR擴增產物的5種酶切圖譜，選擇酶切條帶豐富的3種酶切圖譜，對酶切結果進行聚類分析，結果見表3和圖5。由圖5可見，如果按60%的相似系數，供試菌株可分為4個類群，如果按80%的相似系數，供試菌株可分為14個類群。表3中，供試菌株共有19個ISR遺傳類型，主要類型為編號1、2和4的遺傳類型，編號1的遺傳類型共有13株，編號2有43株，編號4有8株。編號1的遺傳群的菌株大部分聚類于按60%相似系數聚類的第I大群，編號2的遺傳群的菌株全部聚類于按60%相似系數聚類的第Ⅱ大群，編號4的遺傳群的菌株大部分聚類于按60%相似系數聚類的第Ⅳ群中，說明供試菌株中第Ⅱ遺傳群是主要遺傳群。

一般認為，和16S rDNA相比，ISR具有更高的變異性，通過ISR的序列(IGS)分析，更能反映菌株的變異情況，比較適合種以內菌株的遺傳多樣性研究。本實驗中，ISR的酶切結果遺傳類型較少，可能與所選擇的內切酶的種類和數量有關，進一步的研究應對內切酶進行篩選以及對ISR進行IGS序列分析才能得到更準確的結果。

3 結論與討論

16S rDAN基因分析技術和16S～23S rDNA ISR分析技術是細菌多相分類廣泛使用的方法，被廣泛用于乳酸菌的分類鑒定[16]，馬春燕[17]、王英[18]等采用16S rDNA序列分析技術分別對哈薩克族傳統發酵乳酪、新疆酸馬奶中乳酸菌進行了鑒定。本實驗采用16S rDNA酶切聚類和序列分析技術以及16S～23S rDNA的 ISR擴增產物的酶切分析技術初步研究了分離自川西高原牧區牦牛酸奶子中乳酸菌的遺傳多樣性，結果表明，分離菌株主要為乳桿菌屬(Lactobacillus)和腸球菌屬(Enterococcus)細菌；16S rDNA擴增產物的酶切分析，MspI酶切條帶最豐富，供試菌株共有23種16S rDNA基因型，顯示分離菌株有比較豐富的遺傳多樣性，這將為篩選優良菌株提供較豐富的材料。16S～23S rDNA的ISR擴增產物的酶切分析，HinfI酶切條帶最豐富，供試菌株共有19種ISR遺傳型。16S rDNA基因和ISR的酶切聚類分析結果都表明川西高原牦牛酸奶子中具有比較豐富的乳酸菌資源。

自然發酵的牦牛酸奶子是川西北藏民的主食之一，由于其特殊的奶源，高海拔、強紫外線環境，較低的酸奶子發酵溫度，獨特的風味，顯示出發酵過程中乳酸菌類群的特殊性。由于本實驗的采樣點僅在甘孜、阿壩兩州的部分地區，采樣時間也比較集中，后續工作需要在整個生產季節的不同時間，更廣泛的采集樣品，收集更多的菌株，在目前研究基礎上，進一步采用其他方法，如API數值分類，全細胞水溶蛋白分析，特殊基因(RecA基因和RecB基因等)的序列分析等方法，對分離菌株進行更深入研究，以便對該區域牦牛酸奶子中乳酸菌的生物多樣性進行更全面的了解，為其優良菌株的篩選和鑒定提供更豐富的材料。

表3 供試菌株轉錄間區(ISR)擴增產物酶切圖譜類型Table 3 ISR genotype patterns of the PCR products digested by restriction enzymes

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Genetic Diversity and Phylogeny of Lactic Acid Bacterial Strains Isolated from Yak Yoghurt in Western Sichuan Platea

TIAN Hong1，PU Biao2，ZHANG Xiao-ping1,*
(1. College of Resource and Enviroment, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611134, China；2. College of Food Science, Sichuan Agricultural University, Ya，an 625014, China)

The genetic diversity and the phylogeny of 81 lactic acid bacterial strains isolated from yak yogurt samples collected from Western Sichuan Plateau were studied by using 16S rDNA-PCR-RFLP, ISR-PCR-RFLP techniques, and 16S rDNA gene sequence analysis. The results showed totally 23 16S rDNA genotypes were detected and the tested strains could be divided into four taxa on the basis of 61% similarity, and 16 taxa on the basis of 81% similarity. Sequence analysis of 16S rDNA genes showed that genusLactobacillusand genusEnterococcuswere two major genera in all tested strains. ISR-PCR-RFLP analysis also revealed 19 ISR genotypes, and the tested strains could be divided into four taxa on the basis of 60% similarity, and 14 taxa on the basis of 80% similarity.

yak yoghurt；lactic acid bacteria；similarity level；phylogeny

TS252.1

A

1002-6630(2012)05-0170-07

2011-01-22

四川省科技廳科技支撐計劃項目(2010NZ0045)

田鴻(1966—)，男，講師，博士，研究方向為農業及資源微生物。E-mail：tianhongmicrobiol@yahoo.com.cn

*通信作者：張小平(1962—)，男，教授，博士，研究方向為農業及資源微生物。E-mail：aumdwsb@sicau.edu.cn