RP-HPLC同時(shí)檢測(cè)夏天無膠囊2種成分的含量

蘇蘭宜，陳小蘭

（江西省醫(yī)藥學(xué)校，江西 南昌 330020）

夏天無膠囊是依據(jù)《中國藥典》2010年版一部夏天無片進(jìn)行劑型改進(jìn)研發(fā)的中藥新藥，由夏天無單味藥材經(jīng)乙醇提取加工制成，具有活血通絡(luò)、行氣止痛的功效，用于治療瘀血阻絡(luò)、氣行不暢所致的中風(fēng)，半身不遂，跌撲損傷，腫脹麻木，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，坐骨神經(jīng)痛[1]。夏天無中主要含有原阿片堿和延胡索乙素等生物堿類成分，夏天無膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中沒有對(duì)中藥成分的含量控制[2]。單獨(dú)[3]或同時(shí)測(cè)定[4－5]原阿片堿與延胡索乙素的報(bào)道已有，因此本文選擇原阿片堿與延胡索乙素為質(zhì)控指標(biāo)，建立高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定本品中兩種成分的方法，為夏天無膠囊的質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器試藥

Agilent 1200液相色譜儀（美國 ），包括：四元梯度泵、在線脫氣機(jī)、柱溫箱、G1314AVWD檢測(cè)器；Sartorius BS124S電子分析天平；KQ-250VDB型雙頻數(shù)顯超聲機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司），PHS-3C精密pH計(jì) （上海精密科學(xué)儀器有限公司）。夏天無膠囊（0.3g／粒，鄭州韓都藥業(yè)集團(tuán)有限公司）。對(duì)照品：原阿片堿（批號(hào)：110853－200402），延胡索乙素（批號(hào)：110726－200409）均購自中國藥品生物制品檢定所；甲醇（色譜級(jí)），流動(dòng)相用水為雙蒸水（自制）；其余試劑均為分析純。

2 方法結(jié)果

2.1 色譜條件

Venusil XBP-C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.1%磷酸水（三乙胺調(diào)pH 至6.5，54∶46）；柱溫為25℃；流速：1.0mL·min－1。檢測(cè)波長：280nm[5]，進(jìn)樣品量為20μL。

2.2 混合對(duì)照品溶液配制

精密稱取原阿片堿和延胡索乙素對(duì)照品適量，于棕色容量瓶中，加酸性甲醇配制成含109.25μg／mL原阿片堿、25.42μg／mL延胡索乙素混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液母液。

2.3 供試品溶液制備

取夏天無膠囊20粒的內(nèi)容物，研磨成細(xì)粉。取約0.3g，精密稱定，置50mL具塞錐形瓶中，加酸性甲醇25mL，稱定重量，超聲提取1h。冷卻至室溫，再次稱定，用酸性甲醇補(bǔ)足重量，搖勻，0.22μm微孔濾膜濾過，即得。

2.4 陰性對(duì)照溶液制備

按夏天無膠囊處方比例和制備工藝分別制備不含夏天無的膠囊，并按供試品溶液制備方法制備夏天無膠囊的陰性對(duì)照溶液，按色譜條件測(cè)定，結(jié)果陰性對(duì)照樣品對(duì)測(cè)定無干擾（見圖1、圖2、圖3）。

圖1 夏天無膠囊的陰性HPLC

圖2 混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液HPLC

圖3 夏天無膠囊供試品溶液HPLC

分別吸取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照品溶液，按上述色譜條件測(cè)定，采用外標(biāo)法計(jì)算即得。

2.5 測(cè)定方法

2.6 線性關(guān)系考察

分別準(zhǔn)確吸取混合標(biāo)準(zhǔn)品母液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1mL置1mL容量瓶中，酸性甲醇定容，搖勻，即得系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別吸取上述濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液20μL，注入色譜儀，記錄色譜圖。以峰面積（Y）對(duì)濃度（X，μg／mL）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程（見表1）。

表1 線性關(guān)系實(shí)驗(yàn)結(jié)果 （n＝6）

2.7 精密度試驗(yàn)

精密吸取43.7μg／mL原阿片堿與10.17μg／mL延胡索乙素的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液20μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，按色譜條件測(cè)定峰面積值。求得日內(nèi)RSD值，原阿片堿為0.82%，延胡索乙素為1.15%，連續(xù)分析5d；求得日間RSD值，原阿片堿為1.28%，延胡索乙素為1.87%。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、10、12h按上述色譜條件，進(jìn)樣20μL，測(cè)定峰面積。結(jié)果二者色譜峰面積無明顯變化，RSD值原阿片堿為0.94%，延胡索乙素為1.13%，說明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批樣品5份（批號(hào)：20120602），按“2.3”項(xiàng)下方法制備溶液，依法測(cè)定，計(jì)算原阿片堿與延胡索乙素的含量。結(jié)果其RSD值分別為：原阿片堿為0.68%，延胡索乙素RSD為1.42%。

2.10 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的供試品粉末6份，每份重約0.15g（含原阿片堿1.32mg／粒、延胡索乙素0.32mg／粒）混勻，精密稱定，分別精密加入濃度為665.3μg／mL的原阿片堿、164.2μg／mL延胡索乙素混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液1.0mL，按“2.3”項(xiàng)下制備溶液，按色譜條件測(cè)定，測(cè)定峰面積計(jì)算平均回收率，結(jié)果見表2。

2.11 樣品含量測(cè)定

按“2.3”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，按色譜條件測(cè)定含量，結(jié)果見表3。

3 討論

在供試品溶液的制備過程中，本實(shí)驗(yàn)比較了酸性甲醇，以不同比例的甲醇－水溶液，之后比較了回流法、超聲提取的提取效果，結(jié)果以酸性甲醇為溶媒，超聲提取1h，即可較好除去干擾雜質(zhì)又可提取完全，效果最佳。

在流動(dòng)相的選擇上，本實(shí)驗(yàn)比較使用乙腈－三乙胺醋酸溶液、乙腈－水、乙腈－磷酸溶液、甲醇－水、甲醇－磷酸溶液等流動(dòng)相系統(tǒng)，最終以甲醇-0.1%磷酸溶液（三乙胺調(diào)pH至6.5）作為流動(dòng)相系統(tǒng)等度洗脫可將待測(cè)物質(zhì)與雜質(zhì)達(dá)到基線分離，峰形較好，理論塔板數(shù)高，分離效果最好。實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)柱溫25℃比30℃的分離效果更好。

表2 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

表3 夏天無膠囊中兩種成分的含量測(cè)定結(jié)果 （n＝3）

[1]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010：328.

[2]潘成學(xué)，劉偉，申小徑.HPLC測(cè)定夏天無膠囊中原阿片堿的含量[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，40（4）：721-722.

[3]蘇玉嚴(yán)，周海妹，展學(xué)孔，等.HPLC法測(cè)定夏天無薄膜衣片中原阿片堿的含量[J].中國藥房，2010，21（36）：3445-3447.

[4]馬宏達(dá)，郭濤，顏鳴.HPLC法測(cè)定夏天無中原阿片堿延胡索乙素和巴馬亭[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2009，25（3）：208-211.

[5]鄭琴，郝偉偉，楊明，等.RP-HPLC同時(shí)測(cè)定止痛方提取物中6個(gè)成分的含量[J].藥物分析雜志，2011，31（7）：1269-1272.