HPLC雙波長(zhǎng)融合法測(cè)定忍冬藤藥材中三種有效成分的含量

姚 宣，包永睿，孟憲生，王 帥

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 大連 116600）

忍冬藤為忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥莖枝，性甘、寒，歸肺、胃經(jīng)。收載于2010版中國(guó)藥典一部，具有清熱解毒、疏風(fēng)通絡(luò)功能。現(xiàn)代化學(xué)、藥理研究表明：忍冬藤中的主要活性成分為有機(jī)酸類和環(huán)烯醚萜苷類，綠原酸和咖啡酸具有一定的抗菌抗感染作用，在忍冬藤中含量較高，為其主要活性成分，馬錢苷有抗炎作用及調(diào)節(jié)免疫功能作用，三者共同發(fā)揮藥效清熱解毒、疏風(fēng)通絡(luò)，測(cè)定這三個(gè)成分的含量能夠更好地整體評(píng)價(jià)藥材的內(nèi)在質(zhì)量。

本文以高效液相色譜法結(jié)合多波長(zhǎng)融合技術(shù)，根據(jù)三種成分不同的光譜特性，建立了在兩個(gè)紫外檢測(cè)波長(zhǎng)下同時(shí)測(cè)定綠原酸、咖啡酸、馬錢苷三個(gè)成分含量的方法，該方法通過(guò)一針多測(cè)，節(jié)省了時(shí)間，節(jié)約了溶劑，克服了單波長(zhǎng)檢測(cè)時(shí)信息量有限的缺點(diǎn)，以一張圖譜全面、真實(shí)地揭示中藥材的內(nèi)在質(zhì)量特征。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1100Series高效液相色譜儀，二極管陣列檢測(cè)器，自動(dòng)進(jìn)樣，ChemStation工作站（Agilent科技有限公司）；Agilent TC-C18（4.6mm×250mm，5m）；CP225D 電子分析天平（德國(guó)Sartorius，十萬(wàn)分之一）；HS6150型超聲波清洗器（天津恒奧科技發(fā)展有限公司）。

1.2 試藥

綠原酸（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)110753－200413），咖啡酸 （中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)110885－200102），馬錢苷 （中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)111640－200503）；忍冬藤（購(gòu)自大連保健大藥房）經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)翟延君教授鑒定為忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥莖枝，乙腈、甲醇、甲酸，實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent TC-C18（4.6mm×250mm，5m）；流動(dòng)相：A-3%甲酸水，B-乙腈（梯度洗脫程序：0～30min，9%B；31～35min，15%B；36～60min，18%B；61～70min，23%B）；流速：1.0mL／min；柱溫：25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：236、327nm；進(jìn)樣量10μL。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

綠原酸對(duì)照品溶液：精密稱取綠原酸對(duì)照品適量，加50%甲醇制成0.391mg／mL對(duì)照品溶液，備用。咖啡酸對(duì)照品溶液：精密稱取咖啡酸對(duì)照品適量，加50%甲醇制成0.147mg／mL對(duì)照品溶液，備用。馬錢苷對(duì)照品溶液：精密稱取馬錢苷對(duì)照品適量，加50%甲醇制成0.217mg／mL對(duì)照品溶液，備用。

2.3 供試品溶液的制備

取忍冬藤粉碎（過(guò)3號(hào)篩）約1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25mL，稱定重量，超聲處理（250W，30kHz）30min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性關(guān)系

取濃度為0.103mg／mL，0.049mg／mL，0.144mg／mL的綠原酸、咖啡酸、馬錢苷對(duì)照品，精密吸取上述對(duì)照品溶液4、7、10、13、16、19μL，注入液相色譜儀，測(cè)得峰面積積分值。以對(duì)照品的含量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。結(jié)果表明，綠原酸的回歸方程是Y＝21.751X－33.913（r＝0.9999，n＝6），在0.5212～2.4757μg／mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；咖啡酸的回歸方程是Y＝59.891X－27.598（r＝0.9999，n＝6），咖啡酸在0.1960～0.9310μg／mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。馬錢苷的回歸方程是Y＝15.549X－8.5666（r＝0.9999，n＝6），馬錢苷在0.5760～2.7360μg／mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.2 精密度試驗(yàn)

分別精密吸取“2.2”項(xiàng)下配制的綠原酸、咖啡酸、馬錢苷對(duì)照品10μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄236、327nm波長(zhǎng)下的色譜圖，按照最大峰面積覆蓋融合圖譜，結(jié)果融合后圖譜中綠原酸、咖啡酸、馬錢苷各峰相對(duì)峰面積RSD分別為1.07%、0.95%、1.53%，均小于3.00%，表明檢測(cè)系統(tǒng)的進(jìn)樣精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn)

按“2.3”供試品溶液的制備方法，取同一藥材粉末，平行制備供試品溶液6份，按上述色譜條件進(jìn)樣10μL，記錄236、327nm波長(zhǎng)下的色譜圖，按照最大峰面積覆蓋融合圖譜，結(jié)果以融合后圖譜中各峰相對(duì)峰面積計(jì)算綠原酸、咖啡酸、馬錢苷峰含量，RSD 分別為 1.31%、1.26%、1.07%，RSD均小于3.00%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一份供試品溶液，分別在制備好樣品供試液后的0、2、4、6、8、10h進(jìn)樣分析，按上述色譜條件進(jìn)樣分析，記錄236、327nm波長(zhǎng)下的色譜圖，按照最大峰面積覆蓋融合圖譜，結(jié)果融合后圖譜中綠原酸、咖啡酸、馬錢苷各峰相對(duì)峰面積 RSD分別為1.34%、1.63%、1.16%，RSD均小于3.00%，表明樣品在10h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.5 回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的忍冬藤藥材粉末約0.5g，共6份，分別置具塞錐形瓶中，各精密加入適量綠原酸、咖啡酸、馬錢苷對(duì)照品，再精密加入50%甲醇至25mL，超聲處理30min，取出，放冷，按上述方法和條件提取測(cè)定。記錄236、327nm波長(zhǎng)下的色譜圖，按照最大峰面積覆蓋融合圖譜，以融合后圖譜中綠原酸、咖啡酸、馬錢苷峰面積計(jì)算含量，計(jì)算加樣回收率，綠原酸、咖啡酸、馬錢苷平均加樣回收率分別為99.60%、99.73%、99.48%，RSD小于4.00%。

2.5 樣品測(cè)定

按“2.3”項(xiàng)下所述制備供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣，采用多波長(zhǎng)融合技術(shù)，使用Matlab7.1編程對(duì)不同波長(zhǎng)的色譜圖進(jìn)行融合，記錄236、327nm波長(zhǎng)下的色譜圖，按照最大峰面積覆蓋融合圖譜。見圖1、圖2、圖3。

3 討論

中藥化學(xué)成分復(fù)雜，常常通過(guò)多個(gè)成分共同發(fā)揮藥效，單一成分定量難以完整地反映忍冬藤藥材的化學(xué)組分特征，本文將現(xiàn)代分析檢測(cè)手段結(jié)合多波長(zhǎng)融合技術(shù)，對(duì)不同波長(zhǎng)的中藥材指標(biāo)成分的譜圖信息進(jìn)行融合，互補(bǔ)不同類成分特征吸收的差異性，克服單一波長(zhǎng)單一指標(biāo)檢測(cè)時(shí)信息量不足難以完整地反映藥材質(zhì)量的缺點(diǎn)，同時(shí)測(cè)定其中多項(xiàng)指標(biāo)成分含量，獲得每個(gè)成分的最大信噪比，增加了含量測(cè)定的準(zhǔn)確度，在此中藥的多個(gè)指標(biāo)性成分基礎(chǔ)上建立忍冬藤指紋圖譜，科學(xué)合理、綜合地評(píng)價(jià)藥物質(zhì)量，實(shí)現(xiàn)中藥質(zhì)量可控，保證療效。

忍冬藤藥材中主要含有有機(jī)酸類成分、環(huán)烯醚萜類成分，在327nm波長(zhǎng)下，有機(jī)酸類成分綠原酸和咖啡酸有最大吸收，且環(huán)烯醚萜類成分馬錢苷無(wú)吸收，236nm波長(zhǎng)下，環(huán)烯醚萜類成分馬錢苷有最大吸收，有機(jī)酸類成分綠原酸和咖啡酸吸收較小，經(jīng)多波長(zhǎng)融合，記錄236nm、327nm波長(zhǎng)下的色譜圖，按照最大峰面積覆蓋融合圖譜，使用 Matlab 7.1將兩個(gè)波長(zhǎng)的結(jié)果融合，經(jīng)多波長(zhǎng)融合后，藥材的多個(gè)指標(biāo)性成分同時(shí)在一張圖譜中具有最大吸收，從而同時(shí)測(cè)定藥材中有效成分的含量，全面控制藥材的質(zhì)量。

圖1 忍冬藤236nm波長(zhǎng)下HPLC色譜

圖2 忍冬藤327nm波長(zhǎng)下HPLC色譜

圖3 忍冬藤全時(shí)段多波長(zhǎng)融合色譜

流動(dòng)相選擇上考察了甲醇和乙腈兩種流動(dòng)相，乙腈紫外吸收小，產(chǎn)生的噪聲小，適合在進(jìn)行紫外短波長(zhǎng)上的高靈敏度分析，乙腈作為流動(dòng)相壓力較小，對(duì)色譜柱的損害小，洗脫能力強(qiáng)，用乙腈會(huì)比甲醇出峰早，因此乙腈比甲醇更適合于藥材的分離。

本文結(jié)果表明，應(yīng)用多波長(zhǎng)融合HPLC法同時(shí)測(cè)定綠原酸、咖啡酸、馬錢苷結(jié)果準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，可有效控制該藥的質(zhì)量，并且方法簡(jiǎn)單，可以全面整體地評(píng)價(jià)忍冬藤的質(zhì)量。

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