固相萃取高效液相色譜法測定康復新液中有效成分KFX-4

王光強，陳鑒東，徐小軍，胡禮勇

（浙江京新藥業股份有限公司 ，浙江 新昌 312500）

康復新液的主要成分為美洲大蠊（蟑螂）的提取物。功能主治為通利血脈，養陰生肌[1]。康復新液所含成分復雜，真正的活性物質基礎不夠明確。有關美洲大蠊中藥效活性成分的報導較少。隨著科技的進步和研究手段的不斷完善，為了深入了解康復新液中主要藥理作用的物質基礎，以及從分子水平基礎上闡明康復新液的藥效活性成分。我們對美洲大蠊乙醇提取物進行了深入的化學成分研究，并通過活性跟蹤篩選，成功地分離到了一種具有顯著的抗炎、促進肉芽組織增生、創傷愈合等活性作用的化合物單體成分（簡稱 KFX-4）[2]，經確證，其化學名為（3R）-3-甲基-7-羥甲基-8-羥基-3，4-二氫異香豆素-6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，結構式為：

該化合物的檢測方法未見文獻報道。為了了解康復新液中KFX-4的含量水平，我們對康復新液中KFX-4的測定方法進行了詳細的研究，并建立了檢測方法。

1 儀器與試藥

Agilent 1200series高效液相色譜儀（DAD檢測器）；色譜柱（Waters Symmetry C18柱4.6mm×150mm，5μm），Waters公司；固相萃取小柱：Strata-X（60mg／3mL，Phenomenex公司）；康復新液由內蒙古京新藥業有限公司提供；KFX-4對照品：含量：97.7%，浙江京新藥業股份有限公司提供。

2 色譜條件

用甲醇－水（20∶80）為流動相，流速：0.8mL·min－1，色譜柱：Waters symmetry C18柱 （4.6mm×150mm，5μm），柱溫：30℃，檢測波長：265nm，進樣量：5μL。按外標法計算。在選定的色譜條件下，測得的色譜見圖1。由圖1可見，KFX-4峰形良好，且與相鄰雜質峰分離完全。KFX-4峰的DAD全波長紫外掃描，見圖2，顯示最大吸收波長220nm與265nm，由于220nm接近末端吸收，故可選擇265nm為檢測波長。

3 對照品溶液配制

精密稱定KFX-4對照品，用40%甲醇溶解并稀釋制成約20μg·mL－1溶液，即得。

圖1 康復新液中KFX-4的HPLC

圖2 KFX-4紫外吸收圖譜

4 康復新液的預處理

精密移取康復新液10mL，10000rpm，離心10min，取離心清液過反相固相萃取小柱（固相萃取小柱使用前依次用1mL甲醇、1mL水活化），用水2mL洗脫兩次，去除雜質，再用40%甲醇1mL洗脫并收集洗脫液作為供試品溶液。

5 結果

5.1 標準曲線

配制KFX-4對照品溶液貯備液，并分別稀釋制成0.618、1.844、3.688、9.220、18.44、27.66、46.10與92.20μg·mL－1，取上述濃度的溶液注入液相色譜儀，記錄色譜圖，得 KFX-4峰面積分別為7.7、20.5、42.38、106.04、211.66、311.01、528.60與1060.15。以 KFX-4對照品的峰面積（A）和KFX-4濃度（X））為X軸進行線性回歸，得線性方程為A＝11.498X－0.883，相關系數r＝0.99998。表明在0.618～92.2μg·mL－1范圍內，線性關系良好。

5.2 定量限

逐步稀釋KFX-4對照品溶液并注入液相色譜儀，記錄色譜圖，當信噪比約等于10∶1時，此時濃度為0.618μg·mL－1。

5.3 儀器精密度

取濃度21.74μg·mL－1的 KFX-4對照品溶液，連續進樣6次，記錄峰面積，計算RSD為0.3%。

5.4 準確度

采用加樣回收率試驗：精密移取090807批康復新液離心清液5mL，分別加入加樣對照品溶液（19.6μg·mL－1）0.4、0.5、0.6mL，每個濃度3份，共9份，按測定法制成樣品溶液進樣分析，記錄峰面積并計算回收率。

表1 康復新液中KFX-4含量回收率檢測結果（n＝3）

結果表明，該法回收率良好。

5.5 重復性試驗

取090807批康復新液，按測定法測定6次，結果分別為2.03、2.19、2.14、2.06、2.12與 2.07μg·mL－1，平均值2.10 μg·mL－1，RSD為2.7%。

5.6 溶液穩定性試驗

取康復新液制成的供試品溶液，分別在0、2.5、7.5、13.5、26、38、136h進樣測定，記錄峰面積。7次的 RSD為1.1%。

5.7 方法的耐用性

5.7.1 流速影響

在色譜條件中，改變流速為0.7mL·min－1與0.9mL·min－1，其它條件不變，按規定方法檢測供試品溶液，并與正常檢測0.8mL·min－1的數據進行對比。三組數據的總RSD為1.7%。

5.7.2 柱溫影響

在色譜條件中，改變柱溫為25℃與35℃，其它條件不變，按方法檢測樣品溶液，并與正常檢測30℃的數據進行對比。三組數據的總RSD為1.9%。

5.7.3 流動相比例調整

在色譜條件中，改變流動相比例為甲醇∶水＝18∶82或22∶78，其它條件不變，按方法檢測樣品溶液，并與正常檢測（甲醇∶水＝20∶80）的數據進行對比。三組數據的總RSD為1.9%。

5.8 取康復新液樣品

批號為091101、091103與091201的樣品按規定方法進行含量測定，結果 KFX-4含量分別為：1.44、1.37和1.35μg·mL－1。

6 討論

曾嘗試直接離心后的上清液進樣，結果峰面積非常小且雜質干擾很大。嘗試用傳統液－液萃取法將KFX-4從康復新液中提取出來，用正丁醇與氯仿均未能獲得滿意效果，而使用固相萃取技術大大提高了萃取回收率（大于90%），且樣品的凈化效果極佳，洗脫后的樣品液直接進樣，康復新液中雜質對KFX-4無干擾。曾選用D101大孔樹脂柱，結果發現雜質較多，且基線易漂移。比較而言，Strata-X固相小柱的實驗結果最為滿意。通過對KFX-4含量測定方法的驗證，確定了專屬性、重復性、中間精密度、準確度和線性與范圍等符合規定，根據數批樣品檢測結果，本方法可以用于康復新液中KFX-4的控制。

[1]徐小軍.一種二氫異香豆素葡萄糖苷化合物及其制備[J].中國藥物學，2009，12（7）：23.