急性腦梗死血小板活化狀態的檢測及臨床意義

胡 瑛 朱藍玉 張 冬 于增國▲

1.解放軍第二一○醫院檢驗科，遼寧大連 116021；2.大連大學醫學院檢驗系，遼寧大連 116622；3.大連市中醫醫院檢驗科，遼寧大連 116000

急性腦梗死血小板活化狀態的檢測及臨床意義

胡 瑛1朱藍玉2張 冬3于增國2▲

1.解放軍第二一○醫院檢驗科，遼寧大連 116021；2.大連大學醫學院檢驗系，遼寧大連 116622；3.大連市中醫醫院檢驗科，遼寧大連 116000

目的 探討急性腦梗死發病不同時期中血小板的活化狀態以及各項檢測指標的相互關系與臨床意義。 方法 采用FCM測定52例腦梗死患者發病的急性期（發病1～3 d）和穩定期（治療的10～14 d）血小板CD62p和CD63表達率，用玻球法測定PAdT，智能血液凝集儀測定PAgT，同時檢測正常對照組30例。 結果 腦梗死急性期CD62p和CD63表達率較穩定期及正常對照組顯著上調（P＜0.01）；待病情穩定時兩者表達均明顯下降，但亦較正常對照組增高（P＜0.01），且CD62p和CD63表達呈著正相關（r=0.788，P=0.003）；PAdT和PAgT在腦梗死急性期亦較正常對照組顯著升高（P＜0.01），穩定期則降至正常水平。 結論 CD62p、CD63的表達與PAdT、PAgT隨腦梗死病情演變而變化，兩者呈一致性，共同參與腦梗死發生、發展病理過程；CD62p、CD63表達比PAdT、PAgT能更加敏感而準確地反映出血小板活化狀態，且具有較高的一致性，可作為ACI診斷、病情監測及判斷預后的重要指標之一。

腦梗死；P-選擇素；溶酶體蛋白；血小板粘附率；血小板聚集率

急性腦梗死（ACI）是一種嚴重危害中老年人健康的缺血性腦損害性疾病。本病病因病機十分復雜，有研究表明，血小板的高活化狀態在腦梗死形成過程中具有重要作用，是發生ACI重要危險因素之一[1-2]。為此，本研究擬通過對52例ACI患者發病不同時程的血小板黏附率（PAdT）、血小板聚集率（PAgT）和血小板P-選擇素（CD62P）、溶酶體蛋白（CD63）表達率的檢測，進一步研究腦梗死發病過程中血小板的活化狀態，明確血小板各項活化功能檢測指標的相互關系與臨床應用價值，為深入研究ACI發病機制和建立實驗室診斷敏感指標提供科學的依據。

1 資料與方法

1.1 研究對象

腦梗死組：為2011年4月～2011年12月間筆者所在醫院神經內科住院的腦梗死患者52例，其中男28例，女24例；年齡51～82 歲，平均（63.3±12.3）歲；臨床診斷符合全國第五屆腦血管病學術會議修訂的標準，神經功能缺損程度評分（NDS）：輕型16例，中型28例，重型8例。排除肝腎疾病、腫瘤、感染、自身免疫性疾病和代謝性疾病。發病前2周內未服過阿斯匹林、潘生丁等影響血小板功能的藥物和其他抗凝藥物。

正常對照組：系30名來自筆者所在醫院同期健康體檢者，排除冠心病、高血壓、糖尿病史等，與腦梗死組在性別、年齡上比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 主要試劑 單克隆抗體CD62p-FITC、CD63-PE、IgG1-FITC、IgG1- PE，均購自法國Immunotech公司。

1.2.2 主要儀器 流式細胞儀（EPICS-XL型，美國Coulter公司）、血小板粘附儀（中國醫學科學院血研究所產品）、血小板聚集儀（PEA3200型，日本科學株式會社產品）。

1.3 方法

1.3.1 采血時間與標本制備 全部患者于發病的急性期（1～3 d）及穩定期（治療的10～14 d）分別清晨空腹抽取靜脈血，用106 mmol/L枸緣酸鈉抗凝（血與抗凝劑比9∶1），以800 r/min離心5 min，取富含血小板血漿（PRP），用于CD62p與CD63測定。

1.3.2 CD62p與CD63測定 取200μL PRP以等體積2%甲醛固定，再用磷酸緩沖液（PBS）洗滌2～3次，調整血小板濃度為300×109/L，分別加入CD62p、CD63熒光單抗避光室溫混勻孵育30 min，然后用PBS洗滌1次后，加入0.5 mL PBS重懸，采用流式細胞儀進行檢測。測定中用CD41/sslog散點圖設門，流速控制在100～200 s，每份標本測定5 000～10 000個血小板[3]。

1.3.3 PAdT測定 采用玻璃球旋轉法[4]。清晨空腹抽取患者肘靜脈血3.6 mL，以106 mmol/L枸緣酸鈉1∶9抗凝，搖勻后取1.0 mL加入血小板粘附儀中進行檢測。

1.3.4 PAgT測定 采用比濁法[4]。空腹狀態下抽取患者肘靜脈血，抗凝后注入特制的硅化試管中，離心、制備PRP和PPP血漿，取0.5 mL PRP置于血小板聚集儀比濁管內，由微機自動處理并記錄血小板聚集曲線，報告5 min血小板最大聚集率。

1.4 統計學處理

運用統計軟件SPSS11.5，數據采用方差分析進行比較，以（± s）表示，以P＜0.05為差異有統計學意義。相關分析采用直線相關分析（當P＜0.01時為正相關）。

2 結果

2.1 腦梗死組與正常對照組PAdT與PAgT的比較

檢測結果顯示，腦梗死組急性期（1～3 d）PAdT、PAgT較正常對照組顯著升高（P＜0.01）；而穩定期（10～14 d）則降至正常水平。見表1。

表1 腦梗死患者不同時程PAdT、PAgT的變化比較（± s）

表1 腦梗死患者不同時程PAdT、PAgT的變化比較（± s）

注：與正常對照組比較，*P＜0.01

組別 n PAdT（%） PAgT（%）腦梗死組（1～3 d） 52 60.12±11.50* 71.20±16.80*腦梗死組（10～14 d） 52 43.20±7.90 48.30±12.10正常對照組 30 41.70±8.59 49.75±18.98

2.2 腦梗死組與正常對照組CD62p、CD63表達率的比較

腦梗死組急性期CD62p、CD63表達率較正常對照組顯著上調（P＜0.01）；穩定期二者表達率較急性期明顯下降（P＜0.01），但仍較正常對照組增高（P＜0.01）。見表2。

表2 腦梗死患者不同時程CD62p、CD63表達率的比較（± s）

表2 腦梗死患者不同時程CD62p、CD63表達率的比較（± s）

注：與對照組比較，*P＜0.01；與穩定期比較，**P＜0.01

組別 n CD62p（%） CD63（%）腦梗死組（1～3 d） 52 9.01±1.69* 8.15±1.21*腦梗死組（10～14 d） 52 5.12±1.18** 4.03±1.15**正常對照組 30 1.48±0.46 0.89±0.41

2.3 血小板CD62p與CD63表達的相關性分析

經采用直線相關分析，結果顯示腦梗死組血小板CD62p與CD63的表達二者呈顯著正相關（r=0.788，P=0.003）。

3 討論

近年來，隨著“血栓與止血”研究的不斷深入，使血小板在多個系統疾病的病理生理作用機制不斷被發現，為許多生命現象與病理過程增加了新的認識，尤其是血小板高活化狀態在缺血性腦損害過程中所起的作用，以及活化血小板的各項檢測指標相互關系及其應用評價，始終是研究的熱點之一。

眾所周知，血小板粘附功能和聚集功能是活化后血小板所表現出的兩大主要生理功能，是血小板進一步活化、參與止血、促進血液凝固的保證，也是血栓形成的重要基礎。早年，臨床上通常采用PAdT和PAgT作為血小板活化功能主要指標，已有諸多報道在腦梗死形成時活化的血小板粘附性和聚集性均明顯增高。本研究檢測結果亦顯示，腦梗死急性期，患者的PAdT和PAgT均較正常對照組顯著升高（P＜0.01），而穩定期二者則降至正常水平，表明在腦梗死急性期體內存在高凝狀態和血小板的高度活化，這與劉姣[2]報道一致。

近年來，隨著血小板功能檢測技術的不斷進步，血小板的活化程度亦可采用血小板膜蛋白表達高低來判斷[5]。其中，最主要的是存在于血小板胞質內顆粒膜糖蛋白CD62p和CD63。CD62p為血小板α顆粒膜糖蛋白，亦稱P-選擇素；CD63是溶酶體顆粒糖蛋白53，又稱血小板溶酶體蛋白[6]。當血小板活化時，存在于血小板胞質內的CD62p和CD63被迅速動員到細胞表面，介導并啟動血小板與白細胞、內皮細胞粘附，引起血栓并加劇腦組織損傷。因此，CD62p、CD63成為檢測血小板活化程度及血栓形成可靠而特異的標志物[7-8]。本研究檢測結果顯示，在腦梗死發病急性期CD62p與CD63表達均較對正常照組顯著上調（P＜0.01），表明此時血小板功能異常活躍并處于高度活化狀態，直接參與腦梗死病理過程的早期階段。當治療的第10～14天，病情處于穩定期時，CD62p與CD63的表達則明顯下降（P＜0.01），說明CD62p與CD63的表達水平是隨著腦梗死病情演變過程而呈動態變化。但仍較正常對照組高（P＜0.01），可能系腦梗死尚未完全恢復血小板仍處于功能活躍狀態以及CD62p與CD63表達下降較為緩慢之故[9]。經相關性分析顯示CD62p與CD63表達呈顯著直線正相關（r=0.788，P=0.003）。因此，兩者的表達不但與腦梗死病情演變密切關聯，并且具有較高的一致性。

值得注意的是，通過本研究檢測結果分析還發現，在腦梗死發病的急性期，PAdT、PAgT隨著CD62p與CD63表達上調而顯著增高，說明血小板的粘附功能和聚集功能與活化血小板胞質內顆粒膜糖蛋白表達是一致性。段金海等[10]研究證明，CD62p不僅對血小板粘附起促進作用，并且對血小板聚集也具有重要作用。而在腦梗死穩定期時，雖然CD62p與CD63表達仍高于正常對照組（P＜0.01），但PAdT、PAgT卻已降到正常水平，從而證明在腦梗死穩定期時CD62p與CD63表達和PAdT、PAgT并不一致，提示PAdT、PAgT尚不能完全準確地反映血小板活化狀態。因此，CD62p與CD63表達比PAdT、PAgT能更準確地反映出腦梗死的病情變化與程度[11-12]。

總之，通過本研究檢測與分析，表明在腦梗死發病過程中體內存在著血小板高度活化，并通過各種效應直接參與缺血性腦損傷的發生、發展和轉歸過程，是ACI發生的重要危險因素。血小板CD62p與CD63表達的檢測較比PAdT、PAgT能更加敏感的反映出體內血小板活化狀況，從而準確提示缺血性腦血管病的病理變化，對ACI臨床早期診斷、預防和治療、預測病情演變及指導臨床用藥均有重要意義。

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The detection of the platelet activation status of the acute cerebral infarction and its clinical significance

HU Ying1ZHU Lanyu2ZHANG Dong3YU Zengguo2
1.Department of Laboratory, the 210th Hospital of People's Liberation Army,Dalian 116021,China;2.Department of Laboratory,Dalian University of Medicine, Dalian 116622,China; 3. Department of Laboratory, Dalian City Chinese Medicine Hospital, Dalian 116000,China

ObjectiveThis article studies on the platelet activation status during the different phases of acute cerebral infarction and the relationship of indicators in various detections and tells us the clinic significance of the research.MethodsDetermining the expression level of the p-selectin(CD62P)and lysosome membrane protein(CD63)of platelet by FCM during the acute phase(1～3 d after the occurrence)and the stable phase(10～14 d of the treatment)of 52 cases of cerebral infarction,determining the PAdT by glass ball method, and determining the PagT by intelligent blood coagulation instrument and meanwhile detect 30 cases of normal control group.ResultsIn the acute phase of cerebral infarction,the expression level of CD62p and CD63 was significantly higher(P＜0.01)than that of the stable phase and the normal control group.When the conditions of patients were stable,the expression level of CD62p and CD63 was significantly decreased but still higher than the normal control group(P＜0.01),and the expression level of CD62p was obviously positively correlated with that of CD63(r=0.788，P=0.003).In the acute phase of cerebral infarction,PAdT and PagT were both significantly increased than that of the normal control group,but they return to normal level when the illness comes to the stable phase.ConclusionCD62p and CD63,PAdT and PAgT change with the progression of cerebral infarction and show great correspondence,and they all involve in the occurrence and development process of pathogenesis of cerebral infarction.The expression level of CD62p and CD63 with higher consistent was more sensitive and accurate than PAdT and PAgT in reflecting the platelet activation status,it can be used as an important indicator for ACI diagnosis,observation of the disease course and prediction of the prognosis.

Cerebral infarction;P-selectin;Lysosomal membrane protein53;PAdT and PAgT

R446.11+2

A

2095-0616（2012）12-108-03

▲通訊作者

2012-04-25）