芥子氣誘導真皮成纖維細胞分泌腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體的時效和量效研究

楊積順，徐立平，胡晉紅

(1.中國人民解放軍第100醫院藥械科，江蘇 蘇州 215007;2.第二軍醫大學上海長海醫院藥學部，上海 200433)

銀屑病是一種T細胞引發并維持的自身免疫性疾病[1]，患者機體免疫系統紊亂，健康細胞受到攻擊，導致臨床上出現各種形態的皮膚紅斑鱗屑性炎癥病變。銀屑病患者全層皮膚均存在異常，真皮成纖維細胞在銀屑病發展中扮演了重要的調節作用[2]。芥子氣(sulfur mustard，SM)的化學名為“二氯二乙硫醚”，對皮膚有較強的滲透性。腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)的胞外區與腫瘤壞死因子(TNF)和Fas蛋白的配體(FasL)有較高的同源性，屬于腫瘤壞死因子超家族的新型凋亡分子，通過與靶細胞表面的受體結合而發揮生理作用。TRAIL的主要功能是參與變異細胞的凋亡，而對正常細胞沒有損傷。臨床經驗證明，芥子氣軟膏對銀屑病癥狀和機體炎性狀態的改善發揮了重要作用，但其治療機制尚不明確。本研究中探討了芥子氣對真皮成纖維細胞分泌TRAIL的影響，旨在為研究芥子氣治療銀屑病的機制提供參考。

1 儀器、試藥與方法

1.1 儀器、試藥

單道數字可調微量移液器(日本Nichiryo公司);ELX-800型酶標儀(美國Bio-Tek instruments Inc)。血細胞計數板(上海醫用光學儀器廠);細胞培養板、培養瓶、培養皿(Corning-Costar CO.，Becton Dickinson Labware)。膠原酶(CLS-1，Worthington Biochemical Corp.);分散酶，四甲基偶氮唑鹽(MTT)，胰蛋白酶(tissue culture grade)均為 AMRESCO公司產品;小牛血清(GIBCO);DMEM細胞培養基(high glucose，GIBCO/BRL);二甲基亞砜(DMSO，中國醫藥集團上海化學試劑公司);青霉素(80萬U)，鏈霉素(1g)，均為華北制藥股份有限公司產品。Human TRAIL ELISA Kit(Bender Medsystems GmbH)。芥子氣 (SM，第二軍醫大學防化教研室)，密度1.27 g/mL，純度96%，液態;加入10 mL DMEM細胞培養基溶解，得濃度為500μmol/L的貯備液，使用時以DMEM細胞培養基稀釋至規定濃度，現配現用。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養

取采用包皮環切術切下的健康人包皮，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗凈血跡，置0.05%醋酸洗必泰滅菌溶液中清洗、消毒5 min，以磷酸鹽緩沖液沖洗后，盡量去除皮下組織，用手術剪刀將皮膚切成0.5 cm2大小的皮塊，置0.2%的分散酶溶液中，4℃消化過夜。次日取出皮塊，輕輕將消化液蕩干，用鑷子將表皮與真皮層分開;將分離出的真皮層剪碎，放入0.2%膠原酶溶液中，37℃消化4～5 h，去除上層膠原酶，加入15 mL含20%新生牛血清(NBS)的DMEM培養液，反復吹打成細胞懸液，過80目消毒不銹鋼紗網，再過200目消毒尼龍篩網后，1 000 r/min離心10 min，棄除上清液，用20%胎牛血清(FBS)的DMEM培養液重新懸浮，制成細胞懸液，以臺盼藍染色，測定真皮細胞活力。細胞計數，接種于培養瓶中，置37℃及5%CO2的培養箱中培養，2～3 d后換液1次，待細胞生長近融合(70% ～80%)后，以0.25%胰蛋白酶溶液消化，進行傳代，取第5～10代細胞用于后續試驗。

1.2.2 時效關系試驗

取生長良好的真皮成纖維細胞，以0.25%胰蛋白酶消化，制成單細胞懸液。分別用含10%胎牛血清的DMEM培養基和含10%新生牛血清的DMEM培養基調整細胞密度為1×108個/L，接種于24孔細胞培養板，置37℃及5%CO2的恒溫培養箱中培養24 h，待細胞平穩生長至70%～80%融合后，換以無血清DMEM培養基，靜息 24 h。用含芥子氣終濃度分別為 62.50，15.63，7.81，3.91，1.95μmol/L的無血清培養基培養不同時間(24，48，72 h)，以DMEM培養基為空白對照，每組平行設3復孔。吸取上清液，1 000 r/min離心5 min，-20℃保存。采用酶聯免疫吸附(ELISA)法檢測TRAIL的含量。

1.2.3 量效關系試驗

取生長良好的真皮成纖維細胞，以0.25%胰蛋白酶消化，制成單細胞懸液。分別用含10%胎牛血清的DMEM培養基和含10%新生牛血清的DMEM培養基調整細胞密度為1×108個/L，接種于24孔細胞培養板，置37℃及5%CO2的恒溫培養箱中培養24 h，待細胞平穩生長至70%～80%融合后，換以無血清DMEM培養基，靜息24 h。以DMEM培養基為空白對照，每孔加入不同濃度的含芥子氣的無血清培養基，使芥子氣終濃度分別為62.50，15.63，7.81，3.91，1.95 μmol/L。每組平行設 3 復孔，繼續培養24 h。吸取上清液，1 000 r/min離心5 min，-20℃保存。采用酶聯免疫吸附(ELISA)法檢測TRAIL的含量。

1.3 統計學分析

數據以X±s表示，用SPSS10.0軟件分析。

2 結果

在整個試驗中，采用的是經原代培養、傳代10～20代的真皮成纖維細胞。倒置相差顯微鏡下觀察，真皮成纖維細胞呈梭形或長纖維狀，胞體狹長，邊界清楚，胞漿豐富，細胞核呈卵圓形，靠近胞質中央;細胞排列規則，呈漩渦狀或放射狀，隨細胞增殖而布滿培養皿底部，培養2～3 d即可融合。

用不同濃度的芥子氣刺激真皮成纖維細胞24，48，72 h后，酶聯免疫吸附測定結果顯示，真皮成纖維細胞本身可分泌少量的TRAIL，芥子氣刺激可使TRAIL的分泌量增多，并具有明顯的時間和劑量依賴性。結果見表1。

表1 不同時間和濃度的芥子氣刺激真皮成纖維細胞表達TRAIL的量(X ±s，n=3)

3 討論

銀屑病的組織病理既有表皮角質形成細胞的過度增生，還存在真皮乳頭增生、毛細血管擴張，還有學者認為銀屑病皮損也存在成纖維細胞的過度增生。本研究中所選擇的芥子氣濃度均對真皮成纖維細胞沒有毒性，且低于臨床上使用的濃度。近期研究表明，TRAIL能夠阻止自身免疫性疾病的進展，可能對某些慢性自身免疫性疾病的治療有益[3]。TRAIL能選擇性誘導腫瘤細胞的凋亡，而對正常組織和細胞沒有明顯的毒性，是一種極具潛力的抗腫瘤壞死因子，因而受到了國內外學者的廣泛重視和深入研究[4]。銀屑病亦是以細胞過度增生伴炎性細胞浸潤等病理改變的疾病，臨床研究證實，現行許多抗癌藥物對頑固性銀屑病的治療發揮了重要作用，取得了明顯的臨床療效，并且誘導細胞凋亡已成為銀屑病藥物治療的新目標。

本研究結果表明，真皮成纖維細胞自身可以分泌TRAIL，芥子氣刺激后可以顯著上調TRAIL的表達，且分泌趨勢具有明顯的量效和時效依賴性。因此推測，芥子氣治療銀屑病的作用機制可能與其促進TRAIL的分泌，從而發揮抗銀屑病效果有關。

[1]Galadari I，Sharif MO，Galadari H.Psoriasis:a fresh look[J].Clinics in Dermatology，2005，23(5):491-502.

[2]Miura H，Sano S，Higashiyama M，et al.Involvement of insulin-like growth factor-Ⅰin psoriasis as a paracrine growth factor:dermal fibroblasts play a regulatory role in developing psoriatic lesions[J].Arch Dermatol Res，2000，292(12):590-597.

[3]Anel A，Bosque A，Naval J，et al.Apo2L/TRAIL and immune regulation[J].Front Biosci，2007，12(6):2 074-2 084.

[4]Pitti RM，Marsters SA，Ruppeert S，et a1.Induction of apoptosis by Apo-2 ligand，a new member of the tumor necrosis factor cytokine family[J].JBiol Chem，1996，271(22):12 687-12 690.