高效液相色譜法測定腦得生膠囊中羥基紅花黃色素A含量

顧武軍，陳宗良

(1.浙江省寧波市鼓樓街道社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，浙江 寧波 315000;2.浙江省金華市食品藥品檢驗所，浙江 金華 321000)

腦得生膠囊，由三七、川芎、紅花、葛根、山楂5味中藥材組方，具有活血化瘀、疏通經(jīng)絡(luò)、醒腦開竅之功效，用于治療腦動脈硬化、缺血性腦中風(fēng)和腦出血后遺癥等。原質(zhì)量標準[WS3-30(X-30)-2002(Z)]中未對紅花有任何控制指標。而紅花中含有多種黃酮類混合物，具有活血通經(jīng)、祛疲止痛的功效，其中羥基紅花黃色素A(HSYA)是紅花的主要藥效物質(zhì)，是評價紅花及其制劑質(zhì)量的主要指標[1]。筆者建立了腦得生膠囊中HSYA的含量測定方法，為有效控制產(chǎn)品質(zhì)量提供參考依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

Agilent 1200型高效液相色譜儀;梅特勒XS105DU型分析天平(起始0.000 00 g)。HSYA對照品(由江西本草天工科技有限公司提供，經(jīng)高效液相色譜峰面積歸一化法檢查含量大于97%);腦得生膠囊(吉林省華威藥業(yè)有限公司);水為娃哈哈純凈水，甲醇為色譜純(默克公司)，其余為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Zorbax Eclipse XDB-C18柱(150 mm×4.6 mm，5μm);流動相:甲醇-0.5%磷酸溶液(25∶75);檢測波長:403 nm[2];柱溫:35℃;流速:1.0 mL/min;進樣量:20μL。理論板數(shù)按HSYA峰計算大于3 000。

2.2 溶液制備

稱取HSYA對照品0.052 52 g，置100 mL量瓶中，加25%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液。取腦得生膠囊內(nèi)容物，研細，稱取約2.5 g，精密稱定，精密加25%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，用25%甲醇補足減失的質(zhì)量，離心，取上清液用微孔濾膜(0.45μm)濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

陰性干擾試驗:取處方中除紅花外的另4味藥按制法制成陰性樣品，按供試品溶液的制備方法制成陰性對照品溶液，并按擬訂的色譜條件測定。結(jié)果在HSYA對照品峰相應(yīng)的位置未見其他的干擾峰(見圖1)。

線性關(guān)系考察:精密量取對照品貯備液2 mL，置50 mL量瓶中，加25%甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。再精密吸取對照品溶液 1，5，10，20，30，40 μL，分別注入液相色譜儀(每份重復(fù)進樣2次)，按擬訂的色譜條件測定峰面積。以峰面積為縱坐標、HSYA進樣質(zhì)量濃度為橫坐標繪制標準曲線，得回歸方程Y=2 524.7 X+72.831，r=0.999 3(n=6)。結(jié)果表明，HSYA 進樣量在0.021～0.840μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

圖1 高效液相色譜圖

重現(xiàn)性試驗:分別稱取同一樣品6份，按2.2項下方法制備供試品溶液并測定含量。結(jié)果的 RSD=1.77%。

精密度試驗:分別精密吸取對照品溶液10μL，重復(fù)進樣6次。結(jié)果峰面積的 RSD=0.95%，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗:取同一供試品溶液，于制備后 2，4，8，12，24，32 h時分別進樣20μL。結(jié)果峰面積值的 RSD=1.86%(n=6)，表明供試品溶液在32 h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗:精密稱取已知含量的樣品(含HSYA 70μg/g)6 份，分別精密加入對照品溶液 2，2，4，4，6，6 mL，再分別精密加入 25% 甲醇 23，23，21，21，19，19 mL，按上述方法測定含量，計算加樣回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗結(jié)果(n=6)

2.4 樣品含量測定

取3批樣品，按2.2項下方法制備供試品溶液，并按擬訂的色譜條件測定，計算HSYA含量。結(jié)果3批樣品中HSYA的含量分別為 70.0，94.6，73.7 μg/g。

3 討論

HSYA是一種小分子黃酮類成分，呈弱酸性，為改善其峰形及分離效果，在流動相中添加了少量磷酸。通過試驗發(fā)現(xiàn)，選用甲醇-0.5%磷酸溶液(25∶75)，可得到比藥典紅花項下方法更好的峰形，理論板數(shù)更高，故采用本流動相。

曾用甲醇、50%甲醇、25%甲醇作為提取溶劑，進行加熱回流和超聲處理的比較試驗。結(jié)果顯示，25%甲醇超聲處理30 min時提取效率最高，這與HSYA是紅花中的主要水溶性組分特征相符[1]。操作中發(fā)現(xiàn)，直接過濾比較困難，為解決這一難題，采用了離心后再用微孔濾膜過濾的方法。

[1]侯世斌，李江偉，蘇幼紅，等.羥基紅花黃色素A人工抗原的制備[J].中草藥，2008，39(10):1 483-1 486.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:103.