高效液相色譜法測定穩(wěn)心顆粒中非法添加藥物的含量

張士勇，程 軍，葉 云

(安徽省蚌埠市第三人民醫(yī)院藥事辦，安徽 蚌埠 233000)

穩(wěn)心顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《國家藥品標(biāo)準(zhǔn)·新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)(第 23 冊)》[WS3-205(X-029)-99(Z)]，是由黨參、三七、甘松等藥味經(jīng)加工制成的顆粒。由于原穩(wěn)心顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中未列入非法添加抗心律失常類化學(xué)藥物的檢查和含量測定方法，且原穩(wěn)心顆粒補充檢驗方法建立時間較早(2003015)，僅檢測樣品中非法添加的鹽酸普羅帕酮。近年來，抗心律失常類化學(xué)藥物鹽酸普萘洛爾、鹽酸維拉帕米、鹽酸普羅帕酮等[1-3]原料藥物購買容易，可能被不法分子添加到穩(wěn)心顆粒等同類中成藥中，對患者的用藥安全構(gòu)成極大威脅。因此，有必要建立目前較普及的高效液相色譜法，檢測樣品中鹽酸普萘洛爾、鹽酸維拉帕米、鹽酸普羅帕酮等化學(xué)藥物的含量。

1 儀器與試藥

Shimadzu LC-20A型全自動高效液相色譜儀;AE240型電子天平(瑞士Mettler)。鹽酸普萘洛爾、鹽酸維拉帕米對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號分別為 100783-200401，100223-200102);鹽酸普羅帕酮對照品(Sigma-Alorich，068K1558，5G，USA)，由上海安譜科學(xué)儀器有限公司提供。試驗中所用甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純;水為重蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Inertsil ODS-SPC18柱(250 mm×4.6 mm，5μm);流動相:磷酸鹽緩沖液(取磷酸二氫鉀6.8 g，辛烷磺酸鈉1.3 g，加水溶解并稀釋至1 000 mL，用磷酸調(diào)節(jié)pH至3.0)-甲醇(40∶60);柱溫:25℃;流速:0.8 mL/min;檢測波長:223 nm;進樣量:10μL。

2.2 溶液制備

取鹽酸普萘洛爾、鹽酸維拉帕米、鹽酸普羅帕酮對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含鹽酸普萘洛爾、鹽酸維拉帕米、鹽酸普羅帕酮各25μg的溶液，即得對照品溶液。取本品內(nèi)容物，研細(xì)，取約0.5 g，精密稱定，置三角燒瓶中，精密加入甲醇50.0 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率500 w，頻率40 kHz)20 min，放冷，再稱定質(zhì)量，加甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。取供試品溶液適量，加入一定體積的3種對照品貯備液，搖勻，即得含3種對照品的供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗:取鹽酸普萘洛爾、鹽酸維拉帕米、鹽酸普羅帕酮混合對照品溶液，注入液相色譜儀中，結(jié)果3種對照品理論板數(shù)均大于5 000，分離度均大于1.5，拖尾因子均介于0.95～1.05之間，重復(fù)性試驗 RSD均小于1.5%，符合藥典規(guī)定。高效液相色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:分別精密稱取鹽酸普萘洛爾、鹽酸維拉帕米和鹽酸普羅帕酮對照品24.70，25.00，24.87 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇使溶解，定容。再分別精密吸取1.0 mL，置10 mL量瓶中，搖勻，制成每1 mL含鹽酸普萘洛爾0.247 mg、鹽酸維拉帕米0.25 mg和鹽酸普羅帕酮0.248 7 mg的溶液，作為對照品貯備液。分別精密吸取對照品貯備液，加甲醇制成系列質(zhì)量濃度的混合對照品溶液。再分別吸取系列濃度的混合對照品溶液各10μL，注入液相色譜儀，依法測定，記錄色譜圖，計算峰面積積分值 A，以進樣量 C(μg)為橫坐標(biāo)、峰面積積分 A均值為縱坐標(biāo)，得回歸方程，鹽酸普萘洛爾 A=8×106C-27 393，r=1(n=8);鹽酸維拉帕米 A=2×106C-8 214.7，r=1(n=8)、鹽酸普羅帕酮 A=2×106C-5 820.1，r=1(n=8)。結(jié)果表明，鹽酸普萘洛爾、鹽酸維拉帕米和鹽酸普羅帕酮進樣量分別在0.019 76～2.47μg，0.01～2.5μg和0.009 948～2.487μg范圍內(nèi)與峰面積積分均值有良好線性關(guān)系。

精密度試驗:精密吸取1份混合對照品溶液10μL，重復(fù)進樣6次。結(jié)果鹽酸普萘洛爾、鹽酸維拉帕米和鹽酸普羅帕酮峰面積的 RSD分別為0.09%，0.20%和0.21%(n=6)，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗:取同一供試品溶液，室溫下放置，分別于0，1，2，3，18 h時在上述色譜條件下測定。結(jié)果鹽酸普萘洛爾、鹽酸維拉帕米和鹽酸普羅帕酮峰面積的 RSD分別為0.22%，0.28%和0.18%(n=5)，表明供試品溶液在18 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

加樣回收試驗:取同一批號不含鹽酸普萘洛爾、鹽酸維拉帕米和鹽酸普羅帕酮的穩(wěn)心顆粒樣品6份，每份約0.5 g，精密稱定。分別精密加入每1 mL含鹽酸普萘洛爾2.717 mg、鹽酸維拉帕米2.75 mg和鹽酸普羅帕酮2.735 7 mg的混合對照品溶液1.0 mL，置三角燒瓶中，再精密加入甲醇24.0 mL，依法制成供試品溶液。精密吸取每1 mL含鹽酸普萘洛爾2.47 mg、鹽酸維拉帕米2.5 mg和鹽酸普羅帕酮2.487 mg的混合對照品溶液1.0 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，作為對照品溶液。分別吸取供試品溶液和對照品溶液各5μL，注入液相色譜儀，依法測定，計算回收率。結(jié)果鹽酸普萘洛爾、鹽酸維拉帕米和鹽酸普羅帕酮的平均回收率分別為97.11%，97.63%，98.88%，RSD分別為1.85%，1.92%，1.46%(n=6)。結(jié)果表明，方法的準(zhǔn)確性較好。

2.4 樣品含量測定

按照上述擬訂的方法，對山東步長制藥有限公司生產(chǎn)的3批穩(wěn)心顆粒樣品(批號分別為090335，100803，100812)進行測定，結(jié)果未檢出鹽酸普萘洛爾、鹽酸維拉帕米和鹽酸普羅帕酮。

3 討論

在上述色譜條件下，分別精密吸取各對照品溶液10μL，注入液相色譜儀，各色譜峰用PDA檢測器在190～400 nm波長范圍內(nèi)進行光譜掃描，結(jié)果鹽酸普萘洛爾的最大吸收波長為214.5，289.0 nm;鹽酸維拉帕米的最大吸收波長為230.1 nm;鹽酸普羅帕酮的最大吸收波長為247.9 nm、但鹽酸普萘洛爾、鹽酸維拉帕米、鹽酸普羅帕酮在223 nm波長處均有較大吸收值，故選擇223 nm作為其液相色譜檢測波長。

鹽酸普萘洛爾、鹽酸維拉帕米和鹽酸普羅帕酮在甲醇中均易溶或溶解，均比在水中溶解度更好，故選擇甲醇作為供試品的提取溶劑。

試驗中參照文獻[4-10]，分別用流動相為不同比例的0.02 mol/L磷酸二氫鈉-甲醇、0.02 mol/L磷酸二氫鈉-甲醇-乙腈、甲醇-水-冰醋酸-三乙胺、甲醇-0.1%冰醋酸進樣測定。試驗結(jié)果表明，選用不同比例的0.02 mol/L磷酸二氫鈉-甲醇、0.02 mol/L磷酸二氫鈉-甲醇-乙腈為流動相時，鹽酸普萘洛爾與鹽酸普羅帕酮、鹽酸維拉帕米分離度均較好，而鹽酸普羅帕酮與鹽酸維拉帕米保留時間相差小于1 min，分離度小于1.5，不符合《中國藥典》要求，故不選其為本法流動相;選用不同比例的甲醇-水-冰醋酸-三乙胺、甲醇-0.1%冰醋酸為流動相時，鹽酸維拉帕米均未出峰，故不選用其為本法流動相。選用磷酸鹽緩沖液(取磷酸二氫鉀6.8 g，辛烷磺酸鈉1.3 g，加水溶解并稀釋至1 000 mL，用磷酸調(diào)節(jié)pH至3.0)-甲醇(40∶60)作為流動相，鹽酸普萘洛爾、鹽酸維拉帕米和鹽酸普羅帕酮各峰峰形及分離度均較好，穩(wěn)心顆粒樣品在相應(yīng)位置上均無干擾。

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