應用蛋白質組學和組織芯片研究annexin A2在胃癌中的表達*

李秀娟, 劉桂桃, 張志強, 溫 浩, 張桂英, 李茂玉

(新疆醫科大學 1第一附屬醫院消化科,2基礎醫學院病理生理學教研室，3第五附屬醫院職業病科，新疆 烏魯木齊 830011；中南大學湘雅醫院 4 消化科，5衛生部蛋白質組學重點實驗室， 湖南 長沙 410008)

1000-4718(2012)04-0619-06

2011-11-20

2012-02-13

國家自然科學基金資助項目 (No.81001101)；新疆維吾爾自治區自然科學基金資助項目(No.2010211B20)；新疆維吾爾自治區高校科研計劃青年教師科研啟動基金資助項目(No.XJEDU2010S24)；自治區衛生廳青年科技人才專項科研項目(No.2009Y06)

△通訊作者 Tel：0991-4362608 ；E-mail：zhiqiangzhang2011@hotmail.com

應用蛋白質組學和組織芯片研究annexin A2在胃癌中的表達*

李秀娟2, 劉桂桃3, 張志強1△, 溫 浩1, 張桂英4, 李茂玉5

(新疆醫科大學1第一附屬醫院消化科,2基礎醫學院病理生理學教研室，3第五附屬醫院職業病科，新疆 烏魯木齊 830011；中南大學湘雅醫院4消化科，5衛生部蛋白質組學重點實驗室， 湖南 長沙 410008)

目的研究胃癌中膜聯蛋白A2(ANXA2)的差異表達及其與胃癌臨床病理參數的關系。方法激光捕獲顯微切割技術(LCM)純化15例胃腺癌細胞(GAC)和其癌旁正常胃黏膜上皮細胞(NGEC)，采用18O/16O分別標記2種細胞樣本酶切后的多肽混合物。納升級反相液相色譜串聯質譜(Nano-RPLC-MS/MS)定量鑒定GAC和NGEC的差異表達蛋白質。Western blotting驗證差異蛋白ANXA2的表達。免疫組化方法檢測組織芯片中75對胃癌組織和癌旁組織中ANXA2的表達，分析ANXA2表達與胃癌臨床病理參數的關系。結果共篩選出78個差異表達蛋白質，其中ANXA2蛋白的表達水平在GAC中較NGEC中明顯上調(2.32∶1)，Western blotting檢測ANXA2蛋白表達在GAC組升高(P<0.01);免疫組化顯示：ANXA2的表達與胃癌的浸潤深度、淋巴結轉移、分化程度、TNM分期和腫瘤大小相關(P<0.01)，與年齡、性別和遠處轉移無關(P>0.05)。結論ANXA2蛋白的上調可能在胃癌的生物學行為中發揮重要作用。

胃腫瘤； 膜聯蛋白A2； 蛋白質組

膜聯蛋白A2(annexin A2，ANXA2)是Annexins多基因家族中A亞家族重要成員,具有鈣離子介導的磷脂結合特性。ANXA2在人體內皮細胞、單核/巨噬細胞、某些腫瘤細胞和神經細胞等多細胞系均表達,在增生和轉化細胞中高表達,在終末分化的細胞中低表達。ANXA2具有多種重要功能,包括參與膜形成、膜轉運、胞吞、胞吐、信號轉導、細胞遷移、DNA的合成、細胞增殖、分化和凋亡等等多種生物學行為。近年來，ANXA2已成為腫瘤細胞生物學領域中的一個新的研究熱點，研究資料表明其表達失調與人類多種腫瘤的發生、發展、侵潤及轉移密切相關[1]。本研究采用激光捕獲顯微切割技術(laser capture microdissection, LCM)獲得純化的胃腺癌細胞(gastric adenocarcinoma cells, GAC)及正常胃黏膜上皮細胞(normal gastric epithelial cells, NGEC)；應用18O/16O分別標記2種細胞樣本酶切后的多肽混合物，納升級反相液相色譜串聯質譜(nanoliter-scale reverse-phase liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry, Nano-RPLC-MS/MS)鑒定并定量差異表達蛋白質，為進一步驗證蛋白質組學的結果，Western blotting驗證差異蛋白的表達；并用免疫組化(immunohistochemistry,IHC)技術檢測ANXA2在組織芯片中75對胃癌組織和配對癌旁組織中的表達，分析ANXA2與患者年齡、性別、分化程度、轉移、浸潤深度、臨床原發腫瘤-淋巴結轉移-遠處轉移(tumor- lymph node- metastasis，TNM)分期和腫瘤大小(最大徑)等臨床病理參數的關系，以探討ANXA2蛋白差異表達與胃癌發生發展及預后的關系和可能機制。

材 料 和 方 法

1材料和儀器

人類胃癌組織芯片(批號為OD-CT-DgStm01)，上海芯超科技有限公司提供；甲基綠組織染色劑、瓊脂糖、過硫酸銨、丙烯酰胺、亞甲雙丙烯酰胺、甘氨酸、N,N,N′,N′-四甲基乙二胺、三羥甲基氨基甲烷、3-[3-(膽酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸內鹽、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate, SDS)、碳酸氫銨、三氟乙酸和乙睛均為Sigma-Aldrich產品；2D Quant Kit蛋白定量試劑盒、尿素、硫脲、NP-40、Triton X-100、二硫蘇糖醇(DL-dithiothreitol，DTT)、碘乙酰胺和溴酚藍均為Amersham Biosciences產品；蘇木素染色劑和伊紅染色劑由福州邁新生物技術開發公司提供；OCT組織包埋劑購自Leica AS；蛋白酶抑制劑均為Indianapolis產品；98%H218O購自江蘇 Huayi Isotope公司；Immobilized TPCK trypsin為Pierce產品；胰蛋白酶為Promega產品；ZipTipC18為Millipore產品。所用溶液均用 Milli-Q去離子水配制。激光捕獲顯微切割儀(LCM系統)、C1900冰凍切片機為Leica AS產品；ELx800自動酶標儀為Bio-Tek Instruments產品；Hoefer SE 600 垂直電泳槽為Bio-Rad產品；ESI-Q-TOF-MS質譜儀，為Micromass產品。

2方法

2.1標本采集及處理 15例胃腺癌及配對的胃黏膜組織來自2009年6月～10月新疆醫科大學第一附屬醫院普外科手術切除標本。女性6例，男性9例，年齡40～81歲，平均56歲，TNM分期包括Ⅰ～Ⅳ期。手術標本切除30 min內，取胃癌組織及癌旁(距原發腫瘤>5 cm)胃黏膜組織，大小約1.0 cm×1.0 cm×1.0 cm，即刻生理鹽水反復沖洗，去除血液和其它組織，-80 ℃冰箱保存備用于蛋白質組學和Western blotting。所有樣本的獲得和使用均經過患者知情同意和新疆醫科大學倫理委員會的審查同意。

2.2LCM獲取目的細胞及蛋白樣本制備 胃腺癌組織和癌旁胃黏膜組織(8～10 μm)連續冰凍切片，貼于LCM專用薄膜載片上，75%乙醇固定，甲基綠染色；LCM儀分別切割捕獲GAC和NGEC。純化的細胞分別各自混合后加入組織細胞裂解液裂解提取總蛋白，Bradford法測定蛋白濃度。10%SDS-PAGE電泳對裂解后的GAC和NGEC總蛋白預分離，上樣量均為100 μg，電泳好的凝膠行考馬斯亮藍R-250染色；按凝膠顯示條帶把凝膠平行切割成36對配對的蛋白凝膠條帶，經洗滌、脫色、脫水、DTT還原、IAA烷基化和真空離心干燥處理后，加入胰蛋白酶溶液酶解，萃取后，合并為多肽混合物提取液，凍干；然后進行18O/16O標記：在混有immobilized trypsin的多肽混合物中加入8 μL H218O(或H216O)和2 μL乙腈，混勻后37 ℃孵育24 h；標記結束后用1 μL甲酸終止反應。

2.3蛋白質鑒定及質譜數據分析 采用Nano-RPLC-MS/MS技術，在不同含有多肽混合物的Eppendorf管中加入流動相A液(含0.1%甲酸的水溶液)，振蕩，離心，取上清于帶錐底的小瓶中，置于UltimateFAMOS液相色譜系統自動進樣器的樣品架上。用輔助泵，以流動相A液，流速為20 μL/min，10 min后，將樣品上樣至預柱上并脫鹽，后將預柱切換到與毛細管分析柱相連，梯度洗脫。溶劑梯度為：B液(水/乙腈，V/V，并加入0.1%甲酸)，5%B，0～10 min；5%～90%B，55 min；90%B，5 min；90%～100%B，10 min。經過15 min平衡后，進行下一次分離。納升級分析色譜柱的流速約250 nL/min。洗脫液直接通過ESI源離子化進入Q-TOF質譜儀進行分析。采用標準肽段Glu-Fibrino peptide B 對質譜儀進行外標校正，質譜數據經Masslynx 4.0處理產生Peaklist(pkl)文件，采用本地Mascot 2.0查詢IPI數據庫鑒定蛋白質。定量分析采用Masslynx軟件從總離子流(TIC)圖中提取包含待定量肽段的一級質譜，整合產生用于定量分析的質譜圖，根據公式Equation 1[2]計算16O/18O比例。

2.4Western blotting檢測差異蛋白annexin A2的表達水平 樣本為15對顯微切割純化的GAC和NGEC，分別加入4 ℃預冷的組織裂解液；Vortex混勻，冰上裂解30 min；4 ℃，12 000 r/min離心30 min，吸取上清(即為細胞總蛋白質)至新離心管中；Bradford法測定蛋白濃度，-70 ℃保存待用。樣本總蛋白進行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離(上樣量為40 μg)，100V電泳2 h左右；蛋白電泳后轉移至硝酸纖維素膜上；1∶500稀釋的兔抗人annexin A2抗體4 ℃孵育過夜；1∶2 000稀釋的HRP標記的羊抗鼠Ⅱ抗室溫孵育2 h，ECL試劑發光、顯影和定影，所得圖像經掃描，采用Quantity One軟件計算差異蛋白質的相對表達水平。

2.5組織芯片免疫組化染色 按鏈霉素抗生物素蛋白過氧化物酶法免疫組化染色(SP法)試劑盒說明書操作：150點人類胃癌組織芯片(含胃癌組織和配對的癌旁組織各75份)，每點分別加入過氧化物酶阻斷溶液(試劑A)；加正常非免疫動物血清(試劑B)；除去血清后加1∶100 annexin A2抗體；加生物標記的Ⅱ抗(試劑C)；加鏈霉素抗生物素-過氧化物酶溶液(試劑D)，每步用PBS沖洗，室溫孵育；DAB顯色，蘇木素復染，藍化，梯度乙醇脫水，中性樹膠封固。用已知的陽性片作陽性對照；用PBS液代替Ⅰ抗作陰性對照。IHC染色評分：采用Formowitz綜合計分法[3]，據每張切片的染色強度和陽性細胞比例計分：著色強度：無染色0分，淺黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分；每點隨機選取至少10個高倍鏡視野(×200)，至少計數1 000個細胞；細胞中染色陽性細胞數5%為0分； 5%～25%為1分；26% ～50%為2分；51%～75%為3分；>75%為4分；染色強度評分與陽性細胞數比例的評分相加之和2分為陰性(-),2～3分為弱陽性(+)，4～5分為中度陽性(++)，6～7分為強陽性(+++)。

3統計學處理

結 果

1GAC與NGEC的差異蛋白質的分離鑒定

經LCM技術純化的高同質性(>90%)的GAC與NGEC,樣本總蛋白經1D-SDS-PSGE分離、膠上酶切、提取及18O標記，再經Nano-RPLC-MS/MS鑒定，按照18O/16O比值在2倍以上或低于0.5倍為差異蛋白質的標準，共鑒定得到78個差異蛋白，其中42個蛋白在胃癌表達上調，36個蛋白表達降低。差異表達蛋白質涉及代謝酶類、酶解相關蛋白、細胞骨架蛋白、信號轉導相關蛋白和一些功能未知蛋白等；其中ANXA2表達在GAC較NGEC高2.32倍，見圖1。

2Westernblotting驗證差異蛋白ANXA2的表達

Western blotting以β-actin為內參照，以條帶最大灰度值作為1，其它的灰度值與其相除，作為蛋白質相對表達水平。結果顯示：ANXA2在GAC中較NGEC中上調(P<0.01)，據灰度分析的差異蛋白的定量關系，其結果與比較蛋白組分析基本一致，見圖2、表1。

3組織芯片胃癌和癌旁組織中ANXA2蛋白的表達

IHC檢測150點人類胃癌組織芯片，結果顯示：ANXA2蛋白主要在胃癌組織和癌旁組織(正常胃黏膜)的胞漿中呈陽性表達，在部分胃癌細胞膜也有陽性表達。ANXA2蛋白在胃癌中高表達，其在胃癌和癌旁組織細胞中的陰性、弱陽性、中陽性和強陽性表達率分別為：10.6%、18.7%、37.3%、33.3%vs28.0%、32.0%、38.7%、1.3%(P<0.01)，見表2；ANXA2蛋白表達與胃癌浸潤深度、淋巴結轉移、組織分化程度、TNM分期和腫瘤大小相關(P<0.01)，而與患者年齡、性別和遠處轉移無關(P>0.05)，見圖3、表3。

Figure 1. Mass spectrum showing the isotopic distribution patterns of the peptide of annexin A2 (GVDEVTIVNILTNR) and ESI-Q-TOF-MS analysis.A: theoretical isotopic distribution patterns (M0, M2, M4). B:isotopic distribution patterns after18O labeling .I0:unlabelled; I2:single labeled; I4:doubly labeled. C:the amino acid sequence of a doubly charged peptide with m/z 771.83 was identified as GVDEVTIVNILTNR and matched with residues 49～62 of ANXA2. D: protein sequence of ANXA2 was shown. MS/MS fragmentation-matched peptide was underlined.

圖1ANXA2蛋白肽段(GVDEVTIVNILTNR)18O標記質譜峰分布圖和ESI-Q-TOF-MS鑒定結果

Figure 2. The expression of ANXA2 protein in NGEC(N)and GAC(T) detected by Western blotting.

圖2Westernblotting檢測ANXA2蛋白在NGEC和GAC的表達

表1NGEC組和GAC組ANXA2蛋白的表達

GroupANXA2expressionNGEC0.420±0.057GAC0.920±0.058**

**P<0.01vsNGEC group.

Figure 3. The expression of ANXA2 protein in normal gastric mucosa(A),high-differentiated gastric carcinoma(B) and low-differentiated gastric carcinoma(C) (immunohistochemical staining,×200).

圖3ANXA2蛋白在正常胃黏膜和高、低分化胃癌的表達

表2IHC檢測ANXA2蛋白在正常胃黏膜和胃癌中的表達

Table 2. The expression of ANXA2 in normal gastric mucosa and gastric carcinoma detected by IHC [n(%).n=75]

Tissuetype-++++++Normalgastricmucosa21(28.0)24(32.0)29(38.7)1(1.3)Gastriccarcinoma8(10.6)**14(18.7)**28(37.3)** 25(33.3)**

**P<0.01vsnormal gastric mucosa group.

討 論

胃癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，其病變部位隱匿，早期診斷率低，絕大多數胃癌患者就診時已是晚期；加之術后復發、轉移等原因導致胃癌的治療和預后差。探討胃癌的發生發展機制有望改變胃癌患者長期以來生存時間短、化療和放療效果有限的現狀。胃癌既是一種多基因疾病，同時也是一種蛋白質組疾病。蛋白質組學技術在識別腫瘤發生發展過程中相關蛋白質種類、表達水平與修飾的改變、發現腫瘤分子標志物和治療靶標方面具有重要的作用。

表3 胃癌組織中ANXA2表達與各臨床病理參數的關系

國內外有以胃癌細胞株，血清為樣本采用蛋白質組學的方法研究胃癌[4]，發現了一些有意義的分子標志物，如：AMP-18、組織蛋白酶D、胃蛋白酶C[5]等，這對發現和鑒定胃癌相關生物學標記奠定了一定基礎，但目前尚沒有一種腫瘤標志物真正應用于臨床作為胃癌發病前、中、后和進展轉歸預測診斷標記。因此，胃癌的蛋白質組學有待進一步深入研究。本研究采用操作簡單的LCM技術，解決了腫瘤蛋白質組學異質性的問題，快速獲得了同質性達90%以上的純化細胞；結合目前在蛋白質組學領域較先進的18O穩定同位素標記技術結合質譜聯用定量蛋白質學，以人的正常胃黏膜組織和胃癌組織為研究對象，篩選差異蛋白質并進行鑒定。結果發現78個差異蛋白質，其中42個在胃癌細胞較正常胃黏膜上皮細胞高表達，36個則相反呈低表達。這些差異蛋白為胃癌發生發展機制的研究和胃癌分子標志物的篩選奠定了基礎。

在篩選鑒定的差異蛋白質中，ANXA2在胃癌中表達明顯上調。ANXA2的生物學功能非常廣泛[6]。已有研究證實其在不同腫瘤中表達各異，在肝癌、胰腺癌、宮頸鱗狀細胞癌、卵巢交界黏液囊腺瘤和囊腺癌、腎細胞癌[7]和神經膠質瘤等多種組織中上調，為癌基因，而在食管黏膜細胞癌和前列腺癌中則低表達或缺失，為抑癌基因；Emoto等[8]通過免疫組化研究發現人原發性大腸癌中有29.5%的ANXA2高表達，表達水平與腫瘤組織型、體積、分期及侵襲情況有關，Pei等[9]研究發現，ANXA2在有淋巴結轉移結腸癌中的表達較未發生淋巴結轉移結腸癌的表達升高，提示ANXA2上調可作為結腸癌預后的指標。本研究利用了組織芯片技術發現ANXA2在胃癌組織較癌旁組織顯著高表達；分析其與臨床病理參數的關系發現：與胃癌局限于黏膜、黏膜下層、肌層和侵及漿膜下層的相比，ANXA2在腫瘤穿透漿膜層,侵及鄰近結構的組織中表達上調；有淋巴結轉移的較無淋巴結轉移的胃癌組織中ANXA2高表達；高分化胃癌中ANXA2的表達較低分化組下降；隨著TNM分期的增高，ANXA2表達的陽性率也升高；且腫瘤直徑>5cm的ANXA2陽性表達顯著高于其在腫瘤直徑≤5cm的表達。這提示ANXA2與胃癌的生物學行為密切相關，其參與了胃癌發生發展、侵襲和轉移過程，可能是胃癌基因，ANXA2有望成為判斷胃癌預后的重要指標。目前ANXA2參與胃癌生物學行為的機制尚不十分清楚，根據ANX A2的功能及其與其它惡性腫瘤的關系研究[10]，推測其參與胃癌生物學行為的可能機理如下：(1)ANXA2參與DNA合成、調節G2/M+S周期進程而調節胃癌細胞增殖；(2)誘導ERK1/2磷酸化激活MAPK信號通路促進癌細胞生長；(3)ANXA2與c-Myc、t-PA、PLG、PL、組織蛋白酶B以及S100家族等物質的協同作用；(4)形成ANXA2 /p11- F-actin復合體, 調節不同時期腫瘤細胞的黏附和去黏附,調控細胞形變、黏附、遷移以及惡性腫瘤細胞的侵襲和轉移等細胞骨架行為。

本研究采用LCM技術結合高通量定量蛋白質組學方法研究胃癌組織與正常胃黏膜的差異蛋白質，發現并證實了ANXA2在胃癌細胞中呈高表達；應用組織芯片技術免疫組化方法分析ANXA2與胃癌的臨床病理參數關系，結果發現ANXA2與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移、組織分化程度和TNM分期密切相關。研究結果提示，ANXA2可能參與胃癌的發生發展，胃癌組織中ANXA2的高表達可能影響胃癌的生物學行為。其在胃癌中的具體作用機制值得進一步研究，隨著相關研究工作的不斷深入, ANXA2有望應用于胃癌早期檢測、診斷和治療；可能成為判斷胃癌預后的指標和治療的新靶點，為胃癌的診治拓展了新思路。

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StudyofannexinA2expressioningastriccancerbyproteomicsandtissuemicroarray

LI Xiu-juan2, LIU Gui-tao3, ZHANG Zhi-qiang1, WEN Hao1, ZHANG Gui-ying4, LI Mao-yu5

(1DepartmentofGastroenterology,TheFirstAffiliatedHospital，2DepartmentofPathophysiology,CollegeofPreclinicalMedicine,3TheOccupationalDiseasesPreventionandTreatmentInstitution,TheFifthAffiliatedHospital,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China;4DepartmentofGastroenterology,5KeyLaboratoryofCancerProteomicsofMinistryofHealthofChina,XiangyaHospital,CentralSouthUniversity,Changsha410008,China.E-mail:zhiqiangzhang2011@hotmail.com)

AIM: To investigate the differential expression of annexin A2 (ANXA2) in gastric carcinoma and to analyze the relationship between ANXA2 expression and clinicopathological parameters of gastric carcinoma.METHODSPure gastric adenocarcinoma cells (GAC) and normal gastric epithelial cells (NGEC) in 15 patients with gastric cancer were acquired by laser capture microdissection (LCM). All peptide specimens after trypsin digestion were labeled with18O/16O. Quantitatively identification of differential expression of the proteins betweem GAC and NGEC was performed by Nano-RPLC-MS/MS. The expression of ANXA2 in the 2 kinds of tissues was detected by Western blotting. Tissue microarray containing 75 pairs of gastric carcinoma and para-carcinoma tissues was used and the expression of ANXA2 in these specimens was detected by the method of immunohistochemistry (IHC). The relationship between ANXA2 expression and clinicopathological parameters of the pateints with gastric carcinoma was analyzed.RESULTSA total of 78 differential proteins were identified and ANXA2 was up-expressed in GAC (2.32∶1), which was confirmed by Western blotting (P<0.01). The results of IHC showed that the correlations between the expression level of ANXA2 protein and invasive depth (T stage), lymph node metastasis (N stage), histological differentiation, TNM stage and the size of tumor were observed (P<0.01), but the correlations between the ANXA2 expression and sex, age and distant metastasis (M stage) were not found (P>0.05).CONCLUSIONThe up-expressed ANXA2 may play an important role in the biological behavior of gastric cancer

Stomach neoplasms; Annexin A2 protein; Proteome

R735.2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.04.008