聯合應用免疫抑制劑治療大鼠急性脊髓損傷效果觀察

馮新民,李小磊,陶玉平,楊建東,王永祥,王靜成

(揚州大學臨床醫學院江蘇省蘇北人民醫院脊柱外科,江蘇揚州,225001)

急性脊髓損傷(SCI)是脊柱骨折的嚴重并發癥,其神經功能恢復一直是脊柱外科領域研究的難點。近年來研究發現他克莫司(FK506)和FTY720對神經損傷的修復有較好的效果,為脊髓損傷的治療開辟了新視野[1-3]。本實驗旨在觀察大鼠急性脊髓損傷后早期聯合使用FK506和FTY720對神經組織是否起保護作用。

1 材料與方法

選取84只Wsitar大鼠,由揚州大學實驗動物中心提供,體質量 220～280 g,分成4組:FK506+FTY720聯合治療組(A組,24只)、FK506治療組(B組,24只),脊髓損傷組(C組,24只)和正常對照組(D組,12只)。采用Allen打擊模型建立脊髓損傷模型:麻醉成功后切除大鼠T9、T10椎板,重10 g的鐵球從4 cm 高度落下,打擊硬膜囊后,大鼠出現搖尾反射,顯示脊髓損傷模型建立成功。A組一次性通過尾靜脈注射0.3 mg/kg FK506,并予鼻飼0.3 mg/kg FTY720,B組一次性通過尾靜脈注射0.5 mg/kg FK506,C組注射生理鹽水。對照組僅僅做椎板切除。術后分籠飼養,定時按壓膀胱排尿。

分別于術后第6、24和48小時取材,對照組選取3只,其他每組選取6只大鼠。大鼠予以過量戊巴比妥鈉麻醉處死后,取出手術段脊髓,在10%的甲醛溶液中固定24 h后,埋蠟,切片,每個組切片5張備用。隨機從各組各時間點選取切片3張,行蘇木精-伊紅染色法(HE染色)后在光鏡下觀察各組大鼠損傷脊髓組織病理變化。

從各組各時間點剩下的連續切片中隨機抽取2張,參考試劑盒說明書進行 TUNEL法染色檢測凋亡細胞。切片經過組織固定、脫蠟、水化、洗滌、抗原修復之后,每個樣本滴加100 μL TdT酶反應液,避光濕潤37℃反應1 h,其次洗滌、加酶標親和素、DAB法顯色、復染,最后中性樹膠封片。光鏡下觀察:凋亡細胞為棕色,正常細胞為藍紫色統計方法:計算出細胞凋亡指數(AI)=(凋亡細胞數/細胞總數)×100%。

所有動物在淺麻醉下處于睜眼、清醒、四肢肌力下降等狀態,采用肌電誘發電位儀檢測SEP潛伏期,刺激和記錄電極均采用針電極,將電極置于脛前中份肌肉內,參考電極遠側1 cm處,刺激強度3～6 mA,以引起下肢明顯抖動為宜,記錄術前術后的SEP的潛伏期變化情況。術后的記錄時間點為第1、3和7天。

采用斜板試驗和BBB評分法對各組大鼠脊髓損傷后的行為及后肢運動功能進行評定。對照組取3只,其他各組各取6只,分別在術后第1、3、7和14天測定,每項指標共測定3次,以平均值為準。BBB評分者為非本實驗組人員且熟知評分標準。評分前所有動物均排空膀胱,防止因膀胱充盈而影響活動。

2 結 果

對照組各個時間點大鼠脊髓組織結構清晰,未見出血壞死、組織水腫或者變性等情況。損傷組SCI后第6小時,可見明顯組織損傷,SCI區結構破壞,模糊不清,中央管出血,灰質多灶性出血,白質中偶見小片出血;神經元腫脹、壞死,神經纖維水腫,部分結構模糊不清。SCI后第24小時,可見脊髓組織切片發現損傷區主要位于脊髓灰質,在損傷區中央灰質可見大片出血、細胞腫脹、尼氏體消失,細胞空泡變性、部分細胞核固縮,并有大量單核或多核炎性細胞浸潤,有些損傷脊髓組織可出現囊腔樣變化。傷后第48小時,灰質被明顯破壞,損傷中心見壞死空腔形成,殘留周邊部分白質。聯合治療組和FK506治療組大鼠光鏡下觀察的病理學表現較損傷組輕,并且隨著時間的延長,正常的神經元細胞多于損傷組,在各個檢測時間點上神經元、灰白質破壞的情況要輕于損傷組。

對照組罕見凋亡陽性細胞,損傷組、聯合治療組和FK506治療組在傷后第6小時可見凋亡陽性細胞,在傷后第24小時凋亡陽性細胞達到高峰;隨后逐漸減少,至本實驗觀察末期第48小時仍然可見陽性凋亡細胞。聯合治療組和FK506治療組在各個采集時間的陽性率均低于損失組,差異具有統計學意義(P<0.05),但聯合治療組和FK506組差異沒有統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 3組大鼠術后不同時間點脊髓組織凋亡率的比較(,%)

表1 3組大鼠術后不同時間點脊髓組織凋亡率的比較(,%)

與對照組相比,#P<0.05;與損傷組相比,#P<0.05。

分組 n 第6小時 第24小時 第48小時聯合治療組 6 15.19±2.01＊# 24.22±4.72＊# 13.22±1.32＊#FK506組 6 15.48±1.21＊# 24.40±5.26＊# 13.36±1.25＊#損傷組 6 23.04±3.49＊ 34.18±3.95＊ 18.65±1.16#對照組 3 1.28±0.36 1.01±0.21 0.88±0.04

聯合治療組、FK506治療組和損傷組的SEP在術后均高于對照組,有顯著性差異(P<0.05)。聯合治療組和FK506治療組術后第1、3、7天潛伏期與損傷組比較均有顯著性差異(P<0.05),但是聯合治療組和FK506治療組之間差異無統計學意義(P>0.05)。聯合治療組和FK506治療組的潛伏期隨著時間的延長而逐漸降低。見表2。

表2 3組大鼠術后潛伏期的比較(,ms)

表2 3組大鼠術后潛伏期的比較(,ms)

與對照組相比,＊P<0.05;與損傷組相比,#P<0.05。

分組 n 術后第1天 術后第3天 術后第7天聯合治療組 6 10.67±0.44＊# 9.24±0.21＊# 8.02±0.18＊#FK506組 6 10.88±0.64＊# 9.40±0.34＊# 8.28±0.27＊#損傷組 6 11.96±0.13＊ 10.81±0.32＊ 10.12±0.23＊對照組 3 3.75±0.11 3.72±0.08 3.69±0.15

損傷組、聯合治療組和FK506治療組在各個檢測時間點BBB評分和斜板實驗評分均小于正常對照組,差異有統計學意義(P<0.05),見表3、4。損傷組、聯合治療組和FK506治療組大鼠在術后雙后肢肌力完全喪失,并且出現尿潴留和脊髓休克癥狀。術后第3天開始,聯合治療組和FK506治療組大鼠的上述兩項評分開始高于損傷組,差異有統計學意義(P<0.05),但聯合治療組和FK506治療組差異無統計學差異(P>0.05)。

表3 3組大鼠術后不同時間點BBB評分結果比較(,分)

表3 3組大鼠術后不同時間點BBB評分結果比較(,分)

與對照組相比,＊P<0.05;與損傷組相比,#P<0.05。

分組 n 術后第1天 術后第3天 術后第7天 術后第14天聯合治療組 6 1.76±0.25＊# 3.59±0.24＊# 8.08±0.92＊# 15.13±0.86＊#FK506組 6 1.73±0.45＊# 3.50±0.84＊# 7.88±1.07＊# 14.91±1.15＊#損傷組 6 1.35±0.25＊ 2.33±0.52＊ 5.16±0.75＊ 9.17±0.35＊對照組 3 19.88±0.55 20.10±0.55 20.37±0.52 20.23±0.41

表4 3組大鼠術后不同時間點斜板實驗評分結果比較(,度)

表4 3組大鼠術后不同時間點斜板實驗評分結果比較(,度)

與對照組相比,＊P<0.05;與損傷組相比,#P<0.05。

分組 n 術后第1天 術后第3天 術后第7天 術后第14天聯合治療組 6 31.45±2.23＊# 36.58±1.52＊# 43.02±1.94＊# 48.23±2.13＊#FK506組 6 31.00±2.52＊# 36.06±2.52＊# 42.78±2.33＊# 47.83±1.93＊#損傷組 6 30.33±1.86＊ 31.50±2.43＊ 36.50±1.38＊ 40.83±1.60＊對照組 3 63.50±1.28 64.00±0.84 64.00±0.84 64.67±0.80

3 討 論

急性脊髓損傷多指脊髓遭受外力打擊后導致的完全性或不完全性脊髓運動、感覺、括約肌以及反射功能障礙。在脊髓休克期表現為損傷平面以下出現遲緩性癱瘓、運動、反射及括約肌功能喪失和大小便失禁等表現,且預后較差[4-5]。因此,急性脊髓損傷的治療成為目前研究的熱點和難題。

近年來研究[6-7]發現,局部免疫反應引起的繼發性損傷在神經損傷機制中起到重要作用。文獻報道在同種異體肢體移植時常規使用FK506時,發現移植肢體的周圍神經生長速度達到3～4 mm/d,可使得移植肢體提前2個月恢復肢體神經功能[8-9]。潘峰等[3]報道在大鼠急性脊髓損傷后早期應用低劑量FK506可減少神經細胞凋亡,減輕脊髓繼發性損傷,并促進脊髓功能恢復。楊梁等[10]報道FTY720能有效促進大鼠脊髓損傷后神經功能的恢復。

FK506是一種廣泛應用于器官移植術后的免疫抑制劑,可通過與其FK受體結合形成復合物而抑制鈣調神經磷酸酶介導的T細胞活化,阻礙T輔助細胞釋放白介素-2(IL-2)及T殺傷細胞的增殖,從而抑制細胞和體液免疫[11-12]。FK506與其結合蛋白FKBP-12形成FKBP-12復合物通過抑制損傷局部小膠質細胞、巨噬細胞等炎癥細胞的聚集、活化及相關炎癥因子的釋放而減輕繼發性炎癥反應,從而對損傷局部的神經組織起保護作用[13]。FTY720是從冬蟲夏草中提取的一種新型免疫抑制劑,具有免疫效果強、毒副作用小、治療窗較寬等,還具有與其他免疫抑制劑有良好協同作用的特點。FTY720可顯著減少T細胞、B細胞、尤其是CD4+等淋巴細胞的數目,通過調節淋巴細胞對趨化因子的反應性,誘導淋巴細胞歸巢至淋巴結,抑制活化的淋巴細胞對炎癥組織造成的損傷,從而保護機體組織[14]。

本實驗聯合治療組和FK506治療組大鼠斜板試驗評分和BBB評分結果均優于損傷組,但2者之間無顯著性差異。光鏡下可見損傷組術后48 h灰質和白質大部分壞死,而聯合治療組和FK506治療組變化明顯較輕,缺血壞死區較小,無明顯差異,提示FK506和FTY720均具有明確促進脊髓損傷恢復的作用。有研究[15]表明,脊髓損傷后早期細胞凋亡是加重脊髓損傷的重要原因。本實驗采用Tunel細胞凋亡檢測法觀察到損傷早期即可出現大量的凋亡細胞,在24 h達到高峰。損傷組和各藥物治療組在各個取材點的凋亡率有明顯的差異性,進一步說明了FK506和FTY720均具有良好的促進脊髓損傷恢復的作用。

雖然目前FK506和FTY720對神經再生的作用機制尚不是十分清楚,但是大量研究結果表明,FK506和FT Y720對神經的保護作用和促進神經損傷功能恢復的作用是明確的,這可能與藥物通過多種機制抑制了免疫反應,從而改善了SCI傷后的局部微環境,但具體的機制、藥物劑量等尚需進一步實驗研究。

[1]Mulligan S J,Knapp E,Thompson B,et al.A method forassessing balance control in rodents[J].Biomed Sci Instrum,2002,38:77.

[2]Zhang J,Zhang A,Sun Y,et al.T reatment with immunosuppressants FTY720 and tacrolimus promotes functional recovery after spinal cord injury in rats[J].Tohoku J Exp Med,2009,219(4):295.

[3]潘峰,祝成亮,陳安民,等.脊髓損傷后低劑量FK506對傷段組織電解質水含量失衡的早期保護作用[J].中國矯形外科雜志,2007,15(8):1415.

[4]Fehlings M G,Sekhon L H.Acute interventions in spinal cord injury:what do we know,what should we do?[J].Clin Neurosurg,2001,48:226.

[5]鐘玉平,周榮,林軍,等.甲強龍治療急性脊髓損傷的臨床體會[J].浙江創傷外科,2006,11(6):548.

[6]Fabes J,Anderson P,Brennan C,et al.Regeneration-enhancing effects of EphA4 blocking peptide following corticospinal tract injury in adult rat spinal cord[J].Eur J Neurosci,2007,26(9):2496.

[7]邵陽,廖維宏.創傷早期免疫炎性反應與脊髓繼發性損傷[J].創傷外科雜志,2002,4(3):l81.

[8]Sheehan J,Eischeid A,Saunders R,et al.Potentiation of neurite outgrowth and reduction of apoptosis by immunosuppressive agents:implications for neuronal injury and transplantation[J].Neurosurg Focus,2006,20(5):E9.

[9]Hayashi Y,Shumsky J S,Connors T,et al.Immunosuppression with either cyclosporine a or FK506 supports survival of transplanted fibroblasts and promotes growth of host axons into the transplant after spinal cord injury[J].J Neurotrauma,2005,22(11):1267.

[10]楊梁,呂德成,鄭連杰,等.FTY720對大鼠急性脊髓損傷后神經功能恢復的影響及相關機制[J].中國脊柱脊髓雜志,2012,22(4):339.

[11]De Bonis M.,Reynolds L.,Barros J,et al.Tacrolimus as a rescue immunosuppressant after heart transplantation[J].Eur J Cardiothorac Surg,2001,19(5):690.

[12]Assmann,T.,Homey,B.,Ruzicka,T.Applications of tacrolimus for the treatment of skin disorders[J].Immunopharmacology,2000,47(2-3):203.

[13]Keswani S C,Rosenberg B,Hoke A.T he use of GAP-43 mRNA quantification in high throughput screening of putative neuroprotective agents in dorsal root ganglion cultures[J].J Neurosci Methods,2004,136(2):193.

[14]Flǜgel A,Berkowicz T,Ritter T,et al.Migratory activity and functional changes of green fluorescent effect or cells before and during experimental autoimmune encephalomyelitis[J].Immunity,2001,14(5):547.

[15]Whalley K,O'Neill P,Ferretti P.Changes in response to spinal cord injury with development:vascularization,hemorrhage and apoptosis[J].Neuroscience,2006,137(3):821.