DNA甲基轉移酶3b和microRNA-29b在胰腺癌細胞株中的表達及其相關性

王麗華 高軍 杜奕奇 吳紅玉 金晶 李淑德 李兆申

·論著·

DNA甲基轉移酶3b和microRNA-29b在胰腺癌細胞株中的表達及其相關性

王麗華 高軍 杜奕奇 吳紅玉 金晶 李淑德 李兆申

目的明確胰腺癌細胞株甲基轉移酶(DNMT)3b和microRNA-29b(miR-29b)的表達，分析兩者的相關性。方法應用實時定量PCR法檢測人胰腺癌細胞株PANC1、BxPC3、CFPAC、AsPC-1、Capan-2的DNMT3b mRNA和miR-29b表達。采用Pearson直線相關分析法分析兩者表達量的相關性。結果PANC1、BxPC3、CFPAC、AsPC-1、Capan-2的DNMT3b mRNA相對表達量分別為0.497±0.184、0.420±0.168、0.439±0.217、0.122±0.111和0.731±0.387；miR-29b的相對表達量分別為0.745±0.596、0.464±0.430、0.797±1.000、1.836±1.623和0.216±0.335，DNMT3b mRNA的表達量和miR-29b的表達量呈負相關關系(r=-0.922，P=0.026)。結論DNMT3b和miR-29b均參與了胰腺癌的發生發展，兩者呈負相關關系。

胰腺腫瘤； 細胞系，腫瘤； DNA甲基轉移酶3b； 微RNAs

MicroRNA(miRNA)通過與靶基因mRNA上的靶序列互補配對結合，在轉錄后水平上對基因的表達進行負調控，導致mRNA的降解或翻譯抑制[1]。近年的研究發現，miRNAs在多種人類腫瘤中異常表達。雖然其機制尚不清楚，但有研究發現啟動子CpG島異常甲基化在很多腫瘤中與某些miRNAs的下調有關。我們前期的研究發現，DNA甲基轉移酶家族(DNMTs)，尤其是DNMT1和DNMT3b可能參與胰腺癌的發生與發展；胰腺癌患者血漿中存在miRNAs異常表達，尤其是DNMTs異常表達的胰腺癌患者血漿miRNAs表達下調。本研究檢測5株胰腺癌細胞株的DNMT3b和miRNA-29b(miR-29b)表達，并分析兩者的相關性，以明確導致胰腺癌DNMT3b異常高表達的內在調控機制。

材料和方法

一、胰腺癌細胞株

人胰腺癌細胞株PANC1、BxPC3、CFPAC、AsPC-1、Capan-2均購自中國科學院細胞所，常規培養、傳代，收集對數期生長細胞。

二、實時定量PCR

應用Trizol(Sigma公司)抽提各胰腺癌細胞總RNA，分光光度計檢測其純度和濃度。應用Takara公司的PrimeScript TMRT Reagent Kit逆轉錄合成DNMT3b的cDNA；采用美國ABI公司的FG,Taqman(r)microRNA RT Kit逆轉錄合成miR-29b的cDNA；DNMT3b及其內參18S TAQMAN探針、miR-29b及其內參U6 TAQMAN探針均由美國ABI公司設計合成。采用實時定量PCR法同時檢測DNMT3b mRNA和miR-29b的表達。擴增反應程序：95℃ 15 s,60℃ 60 s, 40個循環。通過計算得到的RQ值(RQ=2-△△Ct)表示mRNA的相對表達量。

三、統計學處理

結 果

一、擴增曲線

18S、DNMT3b、U6和miR-29b的擴增曲線見圖1。

圖118S(a)、DNMT3b(b)、U6(c)、miR-29b(d)的RT-PCR擴增曲線

二、胰腺癌細胞DNMT3b mRNA和miR-29b 的表達

PANC1、BxPC3、CFPAC、AsPC-1、Capan-2的DNMT3b mRNA相對表達量分別為0.497±0.184、0.420±0.168、0.439±0.217、0.122±0.111和0.731±0.387；miR-29b的相對表達量分別為0.745±0.596、0.464±0.430、0.797±1.000、1.836±1.623和0.216±0.335(圖2)。

圖25株胰腺癌細胞株DNMT3b mRNA(左)和miR-29b(右)的表達

三、DNMT3b mRNA和miR-29b表達的相關性

5株胰腺癌細胞株的DNMT3b mRNA表達量和miR-29b的表達量呈負相關關系(r=-0.922，P=0.026，圖3)。

圖35株胰腺癌細胞株DNMT3b mRNA和miR-29b表達的相關性

討 論

甲基化修飾是繼基因結構變異即突變和缺失之后的第3種抑癌基因失活機制，其中一種可能的因素是DNMTs高表達和DNMTs復合體調控障礙[2-3]。大多數腫瘤細胞的DNMTs表達明顯高于正常細胞，并與抑癌基因啟動子高甲基化狀態相關[4]。與基因突變引起的癌變不同，由于高度甲基化而導致的抑癌基因轉錄失活并不改變基因本身的序列，因此從理論上說，恢復基因的正常甲基化狀態可以重新激活基因的功能。Luczak等[5]應用反義DNMTs抑制其表達，通過減低DNMTs活性使被高甲基化的凋亡基因恢復活性。

近年的研究發現，miRNA與DNMTs有關。目前已經證實，miR-29家族主要調控DNMT1、3a、3b；miR-148主要調控DNMT-1、3b；miR-143主要調控DNMT-3a；miR-152主要調控DNMT1[6-13]。Fabbri等[7]報道，miR-29家族通過靶向DNMT3a和DNMT3b逆轉肺癌細胞的異常甲基化。Garzon等[8]報道，在急性淋巴細胞白血病中，miR-29b通過直接靶向DNMT3a和DNMT3b及間接靶向DNMT1誘導整體的DNA低甲基化，導致腫瘤抑制基因的重新表達。呂塞群等[14]通過實時PCR檢測，發現PIC細胞感染病毒48 h后， DNMT3a和DNMT3b表達量顯著降低，肝癌細胞miR-29b的表達量與DNMT3a、DNMT3b的表達量呈負相關。本研究結果亦顯示，5株胰腺癌細胞株的DNMT3b mRNA的表達量和miR-29b的表達量呈負相關關系。

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ExpressionofDNMT3bandmicroRNA-29binpancreaticcancercellsandtheirralationship

WANGLi-hua,GAOJun,DUYi-qi,WUHong-yu,JINJing,LIShu-de,LIZhao-shen.

DepartmentofGastroenterology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,ChinaCorrespondingauthor：LIZhao-shen,Email:lizhaoshen111@yahoo.com.cn；LIShu-de,Email：lishude57@126.com

ObjectiveTo investigate the expression of DNMT3b mRNA and microRNA-29b (miR-29b) in pancreatic cancer cells and analyze their relationship.MethodsReal-time RT-PCR method was used to detect the expression of DNMT3b mRNA and miR-29b in five pancreatic cancer cell lines (PANC1, BxPC3, CFPAC, AsPC 1, Capan 2) and the relationship between DNMT3b mRNA and miR-29b expression was analyzed by pearson linear correlation method.ResultsThe expression of DNMT3b mRNA in PANC1, BxPC3, CFPAC, AsPC 1, Capan 2 were 0.497±0.184, 0.420±0.168,0.439±0.217,0.122±0.111 and 0.731±0.387, while the expression of miR-29b were 0.745±0.596, 0.797±1.000,0.464±0.430,1.836±1.623 and0.216±0.335. The expression of DNMT3b mRNA was negatively correlated with the expression of miR-29b (r= -0.922,P=0.026).ConclusionsBoth DNMT3b and miRNA29b are involved in the carcinogenesis of pancreatic cancer, and they are negatively correlated.

Pancreatic neoplasms; Cell line, tumor; DNA-methy1transferases3b; MicroRNAs

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.05.008

國家自然科學基金重大國際合作項目(3091010-3911)

200433 上海，第二軍醫大學長海醫院消化內科

李兆申，Email:lizhaoshen111@yahoo.com.cn；李淑德，Email:lishude57@126.com

2012-05-16)

(本文編輯：屠振興)