DNA甲基轉移酶3b在人胰腺癌組織中的表達及其意義

徐岷 姚志新 朱立寧 徐萍 周志華 龔燕芳 滿曉華 吳鶯 張尤歷

·論著·

DNA甲基轉移酶3b在人胰腺癌組織中的表達及其意義

徐岷 姚志新 朱立寧 徐萍 周志華 龔燕芳 滿曉華 吳鶯 張尤歷

目的檢測人胰腺癌組織中DNA甲基化轉移酶3b(DNMT3b)的表達，分析其與腫瘤臨床病理特征的相關性。方法應用蛋白質印跡法檢測12例配對人胰腺癌和癌旁組織中DNMT3b的表達；免疫組織化學法檢測59例胰腺癌組織中DNMT3b的表達，并分析其與腫瘤臨床病理特征的相關性。結果蛋白質印跡法結果顯示，胰腺癌及癌旁組織DNMT3b蛋白表達量分別為0.69±0.13和0.14±0.03，癌組織的表達量明顯高于癌旁組織(t=4.464，P<0.05)。免疫組化結果顯示，胰腺癌組織DNMT3b陽性高表達率為59%，癌旁組織陰性表達。腫瘤組織DNMT3b表達強度與TNM分期和淋巴結轉移相關。結論DNMT3b在胰腺癌組織中高表達，其表達與腫瘤的惡性生物行為有關。

胰腺腫瘤； 甲基化； DNA甲基轉移酶3b

表觀遺傳異常是腫瘤發生、發展的重要因素之一，它常通過DNA的甲基化、RNA表達沉默和組蛋白修飾3種方式調控基因的表達。DNA的甲基化需要DNA甲基轉移酶(DNA methltransferases, DNMTs)的催化，DNMT活性增高是腫瘤細胞一個具有特征性的早期分子改變，它在人類腫瘤細胞中普遍呈高表達狀態，并導致眾多抑癌基因CpG島異常高甲基化[1]。DNMT3b是在細胞內建立新的DNA甲基化類型所必需[2]。本研究檢測胰腺癌和癌旁組織中DNMT3b的表達，分析DNMT3b表達與腫瘤臨床病理特征的相關性，了解其在胰腺癌發病機制中的作用。

材料與方法

一、組織標本

收集上海長海醫院2008年5月至2011年2月手術切除的新鮮胰腺癌組織及相應癌旁組織12例。其中男性7例，女性5例，年齡46～81歲，平均(63±10)歲；中分化腺鱗癌2例，中分化導管腺癌9例，低分化導管腺癌1例。另收集2007年12月至2011年5月胰腺癌石蠟包埋組織標本47例，其中男性30例，女性17例，年齡31～78歲，平均(60±10)歲；中分化導管腺癌41例，低分化導管腺癌1例，中分化腺鱗癌1例，中分化黏液腺癌4例。所有患者術前均未接受放療及化療。

二、蛋白質印跡法檢測DNMT3b表達

取新鮮胰腺癌及癌旁組織，應用蛋白提取試劑盒(BestBio公司)提取蛋白并定量。常規行蛋白質印跡法檢測DNMT3b表達。鼠抗人DNMT3b單克隆抗體(Abcam公司)工作濃度1∶250，鼠抗人β-actin單克隆抗體(Santa cruz公司)工作濃度1∶2000，與辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗孵育后ECL顯影，用SAGECREATION分析軟件成像及分析條帶灰度，以目的條帶與內參β-actin的灰度比值表示蛋白的表達水平。

三、免疫組織化學法檢測DNMT3b表達

采用UltraSensitiveTM S-P超敏試劑盒(Maixin-bio公司)常規行免疫組化染色，按說明書操作。抗DNMT3b一抗工作濃度1∶500。以PBS代替一抗作為陰性對照。由病理科醫師進行獨立閱片，并以雙盲法評分。DNMT3b定位于細胞核，陽性染色為棕黃色。根據核染色強度和陽性細胞百分率進行評分：無染色為0分，弱染色為1分，中度染色為2分，強染色為3分；無陽性細胞為0分，陽性細胞<10%為1分，10%～50%為2分，51%～80%為3分，>80%為4分。兩評分相乘，0～6分為低表達，8～12分為高表達[3]。

四、統計學處理

結 果

一、胰腺癌和癌旁組織DNMT3b蛋白表達

蛋白質印跡法結果顯示，胰腺癌及癌旁組織DNMT3b蛋白表達量分別為0.69±0.13和0.14±0.03(圖1)，癌組織的表達量明顯高于癌旁組織(t=4.464，P<0.05)。

圖1 胰腺癌組織(T)及癌旁組織(N)中DNMT3b表達

免疫組化結果顯示，59例胰腺癌組織DNMT3b陽性高表達率為59%(35/59)，癌旁組織未見陽性細胞(圖2)。

圖2 胰腺癌(a)及癌旁組織(b)DNMT3b表達(免疫組化 ×400)

二、胰腺癌DNMT3b表達與腫瘤臨床病理特征的關系

胰腺癌組織DNMT3b的表達與腫瘤TNM分期和淋巴結轉移相關(P<0.05)，而與患者性別、年齡及腫瘤部位、大小、浸潤范圍、病理分型、分化程度均無關(表1)。

討 論

DNA甲基化的改變能夠影響與細胞生長、分化、轉化和凋亡等相關基因的轉錄，不但在細胞固有功能和正常細胞的生長過程中起著重要作用，而且也是腫瘤發生、發展的重要因素[4]。催化這一過程的是DNA 甲基轉移酶(DNMTs)，其中DNMT3包含兩個主要成員：DNMT3a和DNMT3b，主要參與從頭甲基化，以非甲基化的DNA為模板，催化新的甲基化位點形成[5]。

表1胰腺癌DNMT3b的表達與臨床病理特征的關系

臨床參數例數DNMT3b高表達低表達χ2值P值性別 男3720171.1410.285 女22157年齡(歲) ≤509632.2170.330 51～591679 ≥60342212腫瘤位置 胰頭3822160.0900.764 胰體尾21138腫瘤直徑 ≤4cm4124170.0340.853 >4cm18117侵及范圍 T1a5411.6930.639 T1b201010 T2261610 T3853病理分型 腺鱗癌3121.2490.536 黏液腺癌431 導管腺癌523121TNM分期 Ⅰ176119.1370.028 Ⅱ20119 Ⅲ20164 Ⅳ220分化程度 中分化5734230.0750.785 低分化211淋巴轉移 有211746.3220.012 無381820

DNMT3b在胚胎細胞中位于染色質，在細胞成熟后散在分布，在功能上起促進胚胎全程從頭甲基化的作用。有研究表明，DNMT3b在多種人類腫瘤中過表達[6]，在癌前病變向癌的轉變過程中也發現DNMTs表達增強[7]。DNMT3b在結腸癌中靶向許多重要的抑癌因子和轉錄因子，特別是結腸癌的HOXB13基因上游CpG島甲基化[8]。結腸癌組織HOXB13過量表達能夠上調Igf2表達和沉默癌抑制基因Sfrp2、Sfrp4和Sfrp5的轉錄[9]。DNMT3b還具有管理PRC1的功能[10]。DNMT1和DNMT3b還可以調節組蛋白修飾，通過聚集CTCFL/BORIS活化BAG-1基因和調節組蛋白啟動子甲基化[11]。敲除DNMT1和DNMT3b可以增加CXCR4在轉錄和翻譯水平的表達，說明在腫瘤形成過程中DNMTs起著重要的作用[12]。

本實驗結果顯示，胰腺癌組織DNMT3b蛋白表達顯著高于其配對的癌旁組織，DNMT3b陽性高表達率為59%，說明DNMT3b可能與胰腺癌的發生發展有關。通過DNMT3b表達與腫瘤臨床病理特征的分析，發現DNMT3b表達與胰腺癌TNM分期和淋巴結轉移相關，提示其表達水平能夠反映胰腺癌的惡性行為，可能成為判斷胰腺癌預后的分子標志物及新的治療靶點。

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ExpressionandroleofDNMT3binhumanpancreaticcancertissue

XUMin,YAOZhi-xin,ZHULi-nin,XUPing,ZHOUZhi-hua,GONGYan-fang,MANXiao-hua,WUYing,ZHANGYou-li.

DepartmentofGastroenterology,AffiliatedHospitalofJiangSuUniversity,JiangSu212001,China

ZHANGYou-li,Email:zjyouli@yahoo.com.cn

ObjectiveTo investigate the expression of DNMT3b and its correlation with clinicopathological parameters of pancreatic cancer.MethodsThe expressions of DNMT3b protein in 12 pancreatic cancer tissues and para-cancerous tissues were detected by Western blot. The expressions of DNMT3b protein in 59 pancreatic cancer tissues were detected by immunohistochemistry. The association of DNMT3b expression and clinicopathological parameters of pancreatic carcinoma were analyzed.ResultsWestern blot results showed the expressions of DNMT3b protein in pancreatic cancer tissues and para-cancerous tissues were 0.69±0.13and0.14±0.03, and the protein level of DNMT3b in pancreatic cancer tissues were significantly higher than that in para-cancerous tissues (t=4.464,P<0.05). Immunohistochemistry examination showed that the positive rates of DNMT3b protein were 59% in pancreatic cancer tissues and negative in para-cancerous tissues. DNMT3b expression was positively correlated with the TNM stage and lymph node metastasis.ConclusionsDNMT3b is highly expressed in pancreatic cancer tissues, and it is related with malignant biological behaviors of pancreatic cancer cells.

Pancreatic neoplasms； Methylation； DNA methyltransferase 3b

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.05.010

江蘇省自然科學基金(BK2009210)；江蘇省衛生廳科研項目(H200836)；鎮江市科研計劃項目(SH2009012)

212001 江蘇鎮江，江蘇大學附屬醫院消化科(徐岷、姚志新、朱立寧、徐萍、吳鶯、張尤歷)；解放軍第101醫院病理科(周志華)；第二軍醫大學長海醫院消化科(龔燕芳、滿曉華)

張尤歷，Email：zjyouli@yahoo.com.cn

2012-05-17)

(本文編輯：呂芳萍)